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1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗于2010年12月至2012年10月在金陵科技學院幕府校區(qū)試驗站進行。穴盤育苗至3～5片真葉時定植到田間,正常栽培管理,翌年3月植株開始抽薹后進行取材。

1.2試驗方法

1.2.1取材和染色處理

于晴天上午10:00左右取完整花序。根據(jù)花蕾形態(tài)特征,將處于不同發(fā)育時期的花蕾分為以下5等級:小于<1.49mm,1.50～1.99mm,2.00～2.49mm,2.50～3.0mm,>3.00mm等5個級別。取不同級別的花蕾,用卡諾氏液固定24h,70%酒精中保存?zhèn)溆?。利用稀?倍的愛氏蘇木精整體染色,用蒸餾水進行還藍處理1～2d。

1.2.2石蠟切片法參考

方法并改進,用30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→85%乙醇→95%乙醇→純乙醇處理各3～5min,最后用吸水紙吸干多余的乙醇。透明處理為等量無水乙醇及二甲苯1～2h,二甲苯1～2h。放入二甲苯和石蠟各半的混合液15min,再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各20～30min。將經過透蠟的組織連同熔化的石蠟,一起倒入容器內,然后立放入包埋機中,使其立刻凝固成蠟塊。調整厚度調節(jié)器到所需的切片厚度為8μm,用電腦快速冷凍石蠟兩用切進行切片。取1片清潔的載玻片,滴1滴粘片劑于玻片中央,然后用洗凈的手指加以涂抹,便成均勻薄層,滴1～2滴的蒸餾水于已涂粘片劑的載玻片上。用小鑷子夾取預先用刀片割開的蠟帶,放在水面上,注意蠟片光亮平整的一面貼于玻片上,然后放在展片機上烘干,溫度為75°C左右。石蠟切片經二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5～10min,然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各級酒精溶液中各3～5min。用阿拉伯樹膠封存并使用顯微鏡鏡檢拍照記錄。

2結果與分析

2.1普通白菜花蕾長與花粉發(fā)育時期的關系

此時適宜取材進行花藥或小孢子培養(yǎng)。當花蕾長在2.50～3.00mm時,夏綠2號中90%的花粉處于單核期,其余花粉處于第一次分裂時期或雙核期;夏浪中95%的花粉處于單核期,其余花粉處于第一次分裂時期或雙核期;京冠1號處于單核期花粉為98%,其余花粉處于第一次分裂時期或雙核期。此時是最適宜進行花藥或小孢子培養(yǎng)的時期。當花蕾長>3.00mm時,小孢子進入雙核期和三核的成熟花粉粒時期,單核期花粉低于10%,此時已經不適宜進行花藥或小孢子培養(yǎng)。

2.2菜薹花蕾長與花粉發(fā)育時期的關系

日本甜脆的單核花粉百分率在2.50～3.00mm的時候最高;而50天油綠菜心和80天油綠菜心的單核花粉百分率在1.50～2.49mm的時候最高。由此可得:日本甜脆取材的最佳時期在花蕾長為2.50～3.00mm;50天油綠菜心取材的最佳時期在花蕾長為1.50～2.49mm;80天油綠菜心取材的最佳時期在花蕾長為1.50～2.49mm,而在花蕾長為3.50～4.00mm的時候則都不適合取材。

3結論與討論

3.1花粉各發(fā)育時期特征

普通白菜和菜薹的花粉發(fā)育的各個時期與其他十字花科植物相似。單核靠邊期,細胞壁加厚成三裂狀,細胞核至細胞壁的一側;雙核期,細胞逐漸成橢圓形,形成兩個大小不同的細胞,體積大的為營養(yǎng)細胞,體積小的為生殖細胞;三核期,花粉內可看到3個核,即1個營養(yǎng)核和2個精核。三核期內有大量花粉積累,成為成熟花粉粒。由此得出,通過對花粉細胞各個發(fā)育期細胞特有形態(tài)特征的觀察,可以快速判斷出花蕾中花粉細胞所處的時期,如小孢子表現(xiàn)為正圓性狀,細胞核被擠到細胞邊緣,即為單核靠邊期的特征標志。

3.2花蕾長度與花粉發(fā)育時期的關系

花蕾大小與小孢子發(fā)育階段關系密切,因此根據(jù)花蕾長度取材是一種快捷、準確地用于花藥或游離小孢子培養(yǎng)選擇花蕾的方法。本試驗認為,花蕾長度在2.00～3.00mm時,花粉基本處于單核后期和雙核早期。對于普通白菜,2.50～3.00mm長的花蕾絕大多數(shù)花粉處于單核靠邊期和雙核早期,是進行花藥或小孢子培養(yǎng)的適宜取材時期;對于菜薹而言,1.50～3.00mm長的花蕾絕大多數(shù)花粉處于單核靠邊期和雙核早期,是進行花藥或小孢子培養(yǎng)的適宜取材時期。2.00～3.00mm長的花蕾適宜進行花藥或小孢子培養(yǎng),這與青花菜[5]雄配子體的動態(tài)發(fā)育過程結果較為一致。

3.3石蠟切片法的特點

石蠟切片法是植物組織學和發(fā)育生物學研究中常用的實驗方法,通過使用石蠟包埋所需觀察的組織(如葉片組織、花芽分化組織等),經切片得到的制片可進一步用于細胞學研究。同其他方法如薄片切片法等相比,石蠟切片法能包埋較大塊的材料,可觀察的細胞視野也較全,適合觀察組織整體的連續(xù)發(fā)育過程。雖然石蠟切片的制作過程并不復雜,但影響切片質量的因素較多,如脫水時間、包埋溫度、染色液的選擇等,因此要制備1張高質量的石蠟切片,每一個操作步驟都非常關鍵。本試驗采用石蠟切片法,對白菜不同變種‘普通白菜’和‘菜薹’的花蕾進行組織包埋、固定和切片,鑒定出花粉細胞發(fā)育的各個時期,并根據(jù)外觀長度大小找出單核靠邊期的花蕾特征,以期為白菜花藥或小孢子培養(yǎng)提供取材依據(jù)。

作者：王倩曾靖陶琪何靜雯徐宜霞崔群香朱麗梅單位：金陵科技學院園藝學院