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本文作者：李璽洋1,2白俊杰1于凌云1梁旭方1作者單位：1華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院2中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所

結(jié)果

1突變序列篩選和草魚醛縮酶A3''''UTR分析

經(jīng)直接測序及DNAstar軟件分析結(jié)果顯示在草魚醛縮酶AmRNA3''''UTR內(nèi)靠近polyA識別位點(diǎn)一端存在約由425個堿基組成的AU富含區(qū)，與眾多基因的3''''UTR高度同源。經(jīng)比對分析，得出醛縮酶AmRNA3''''UTR存在一些特殊原件，如:AU富含元件ARE反應(yīng)中心，和缺氧反應(yīng)元件(HIF-1)中的核心序列5''''-ACGT-3''''。醛縮酶3''''UTR17bp插入序列“TGAACGCATCTGT-GCTC”位于AU富含區(qū)61bp處，離ARE反應(yīng)中心差111bp和324bp。

2插入序列在草魚群體中的多態(tài)性分析

將含有17bp插入序列的基因型用A表示，不含有插入序列用B表示。在草魚群體中存在AA、AB、BB三種基因型。對三種基因型進(jìn)行卡方分析，基因型頻率分析和遺傳參數(shù)分析(見表1和2)?？ǚ椒治霰砻?，P值大于0.05，說明插入突變基因型頻率符合Hardy-Weinberg定律。經(jīng)多態(tài)信息含量(PIC)檢測為0.32，屬于中度多態(tài)性。

3插入序列與草魚生長性狀關(guān)聯(lián)分析

對草魚醛縮酶A3''''非翻譯區(qū)插入片段三種基因型與形態(tài)性狀進(jìn)行一般線性模型(GLM)分析，結(jié)果見表3。該插入位點(diǎn)不同基因型在體寬，吻長生長性狀上有顯著差異(P＜0.05)，值分別為0.012和0.049。BB型個體在體重、體寬、眼間距、吻長、肛前距、全長、體長、尾柄長和體高上均比AB和AA型個體顯示出較高的生長優(yōu)勢，尤其在體重方面，BB型草魚體重比AA型草魚體重增加8.37%，BB型草魚在生長性狀方面較另外兩種基因型草魚占優(yōu)勢。

討論

1醛縮酶A3''''非翻譯區(qū)插入序列的功能探討

真核生物基因表達(dá)的調(diào)控序列大多群集于5''''和3''''非翻譯區(qū)，調(diào)控蛋白與3''''UTR中的順式作用元件結(jié)合而影響mRNA穩(wěn)定性，降解速率，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄本亞細(xì)胞定位和翻譯水平來調(diào)控基因表達(dá)［4］。例如人類3''''非翻譯區(qū)中高度保守的miRNAs與靶基因結(jié)合形成雙鏈來促進(jìn)mRNA的降解，抑制蛋白質(zhì)翻譯［5］。真核生物醛縮酶A3''''非翻譯區(qū)在基因轉(zhuǎn)錄后水平、mRNA的穩(wěn)定性、基因表達(dá)翻譯等方面的研究已有報(bào)道［6-7］。例如:Semenza［8］報(bào)道人醛縮酶A基因3''''-UTR上具有缺氧反應(yīng)元件(HIF-1)中的核心序列5''''-ACGT-3''''［9］，HIF-1與核心序列結(jié)合，在3''''端功能序列作用下［10］，可增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)了醛縮酶A蛋白水平的增加，加速糖的酵解，為組織提供更多的能量［11-12］。為分析此插入突變?nèi)绾斡绊懭┛s酶A3''''-UTR的表達(dá)調(diào)控功能，本實(shí)驗(yàn)分析了醛縮酶3''''-UTR結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其區(qū)域含有一些特殊元件，如AU富含區(qū)，國內(nèi)外文獻(xiàn)都有關(guān)于AU富含區(qū)功能［5］的報(bào)道，大部分都是關(guān)于人的，其機(jī)制是富含AU穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域使mRNA的polyA尾快速縮短至20～40個(A)寡聚尾，從而加速mRNA的降解，另一方面還可與相應(yīng)蛋白因子結(jié)合，調(diào)控mRNA的降解，使翻譯效率下降［13］。例如人鈉離子依賴性二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SDCTβ3''''-UTR的AU富含區(qū)可進(jìn)行基因表達(dá)負(fù)調(diào)控，降低mRNA穩(wěn)定性，促進(jìn)mRNA的降解［14］。本實(shí)驗(yàn)17bp插入突變序列位于AU富含區(qū)內(nèi)，推測此插入突變點(diǎn)可通過AU富含區(qū)影響醛縮酶A蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響醛縮酶A蛋白在糖酵解過程中功能的發(fā)揮。根據(jù)此突變點(diǎn)對草魚生長性狀的影響，推測此插入突變點(diǎn)可能通過AU富含區(qū)促進(jìn)醛縮酶AmRNA降解，具體加速還是降低還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

2醛羧酶A3''''非翻譯區(qū)插入突變可用于育種

魚類大多對糖的利用能力低下，草魚更被視為先天性“糖尿病體質(zhì)”［15］。醛縮酶作為糖酵解中的關(guān)鍵酶，其基因突變對糖代謝甚至對機(jī)體生長的影響更值得關(guān)注，相關(guān)研究有很多，例如CROSS等［16］在遺傳性果糖不耐受癥患者的醛縮酶B基因外顯子上發(fā)現(xiàn)了3個錯義突變，導(dǎo)致酶蛋白功能的缺陷，導(dǎo)致糖不能進(jìn)一步代謝，出現(xiàn)體重不增，生長緩慢等臨床癥狀。環(huán)境條件改變會引起基因突變。推測醛縮酶的這種插入突變可能是野生草魚和養(yǎng)殖草魚食性改變，對糖利用程度不同引起的。人工養(yǎng)殖草魚飼料中糖類物質(zhì)為淀粉，野生草魚以食草為主，草中主要成分為纖維素。淀粉，纖維素需淀粉酶和纖維素酶催化水解成葡萄糖，再進(jìn)入糖酵解過程，兩種糖及各自的水解酶的結(jié)構(gòu)，活性等均不同，對醛縮酶的活性影響程度也不同。食物的差異，糖類物質(zhì)水解酶的差異以及糖酵解過程的主要酶含量及活性不同，導(dǎo)致醛縮酶基因突變。草魚醛縮酶A全序列已全部成功克隆，本實(shí)驗(yàn)采用關(guān)聯(lián)分析法對草魚醛縮酶A基因3''''非翻譯區(qū)多態(tài)性序列與生長性狀進(jìn)行分析研究。BB型草魚在生長性狀方面較另外兩種基因型草魚占優(yōu)勢。可以考慮將醛縮酶A基因的多態(tài)性作為分子標(biāo)記用于生長快速草魚的選育。