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醫(yī)學(xué)畢業(yè)論文

銀屑病中細胞凋亡相關(guān)基因bcl-2、Fas、bax的檢測

摘要為了探討細胞凋亡相關(guān)基因bcl-2、Fas、bax在銀屑病發(fā)病中的意義，采用免疫組化ABC法、SABC法檢測了這幾種基因在15例銀屑病組織中的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)銀屑病的角質(zhì)形成細胞中抑凋亡基因bcl-2幾乎不表達，促凋亡基因Fas、bax陽性表達。提示促凋亡基因Fas、bax在銀屑病中發(fā)病起重要作用，而抑凋亡基因bcl-2作用可能不大。

關(guān)鍵詞銀屑病、bcl-2基因、Fas基因、bax基因。

銀屑病的發(fā)病機理尚不明確，角質(zhì)形成細胞異常增生和角化不全是銀屑病的主要病理改變，以往對這方面的研究主要集中在免疫學(xué)和生化學(xué)方面。近年來銀屑病與細胞凋亡的關(guān)系逐漸受到越來越多學(xué)者的重視。國外有學(xué)者報道銀屑病表皮中角質(zhì)形成細胞凋亡異常增多。抑凋亡基因bcl-2和促凋亡基因Fas、bax是現(xiàn)今研究較多、較重要的幾個細胞凋亡相關(guān)基因。為了探討這幾種基因在銀屑病發(fā)病中的意義，我們采用免疫組化方法檢測了銀屑病中細胞凋亡相關(guān)基因bcl-2、Fas及bax。

1材料和方法

1．1標本來源：采用1994-1997年我院保存的石蠟包埋組織塊。尋常型銀屑病15例，其中男8例，女例；年齡11-68歲，平均年齡29.13歲；均為進行期銀屑病。6名正常人皮膚組織，皆取自皮膚外科行重瞼術(shù)、面部美容切除術(shù)者的皮膚，石蠟包埋作為對照組。測定前先將石蠟包埋組織塊作常規(guī)組織切片及HE染色，在光鏡下核對診斷，證實其病理診斷無誤方采用。

1．2試劑：鼠抗人bcl-2單克隆抗體購自Dako公司，生物素化羊抗鼠單克隆抗體系華美生物制品公司產(chǎn)品。兔抗人Fas多抗、兔抗人bax多抗及鏈酶親和素-生物素-過氧化酶復(fù)合物免疫組化試劑盒（簡稱SABC試劑盒）均購自武漢博士德生物工程公司。

1．3方法：載玻片用APES處理后干燥備用，切取4-5μm厚的石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化。Bcl-2基因的檢測參照ABC法稍加改進，陽性對照為正常淋巴結(jié)，陰性對照為不加一抗。Fas、bax基因的檢測采用SABC法，陽性對照分別為武漢博士德生物工程公司提供的Fas、bax基因陽性對照片，陰性對照為不加一抗。

1．4判斷：顯微鏡下觀察，棕黃色為陽性結(jié)果。陽性強度判斷標準如下：強陽性（）指50%以上細胞陽性染色；中等強度陽性（）指25%-50%細胞陽性染色；弱陽性（）指25%以下細胞陽性染色；陰性（-）指細胞均無任何陽性染色。

2結(jié)果6例正常人皮膚組織中：bcl-2基因除部分基底細胞呈陽性反應(yīng)外，余陰性。、Fas和bax基因為陰性表達。15例銀屑病組織中：bcl-2基因在15例表皮增生的角質(zhì)形成細胞中均呈陰性表達，但14例部分基底細胞和浸潤的淋巴細胞呈陽性染色；Fas基因在12例銀屑病組織中呈陽性表達；bax基因在13例中呈陽性，陽性染色遍布表皮各層角質(zhì)形成細胞中及真皮淺層浸潤的淋巴細胞上。在缺少一抗的對照反應(yīng)中結(jié)果均為陰性，而作為陽性對照的正常淋巴結(jié)及Fas、bax基因陽性對照片則呈廣泛強陽性染色。

3討論bcl-2基因最早是1984年Tsujimoto等從濾泡性淋巴瘤中分離出來的一種癌基因，位于18q21位點的bcl-2基因移至免疫球蛋白重鏈基因14q32位點附近，造成bcl-2蛋白的異常表達。bcl-2基因可抑制許多因素引起的細胞凋亡，故稱為：“細胞凋亡抑制基因”。Fas抗原又稱Apo-1或CD95，F(xiàn)as分子是個典型的Ⅰ型膜蛋白，屬腫瘤環(huán)死因子（TNF）/神經(jīng)生長因子（NGF）受體家族中的一員。研究發(fā)現(xiàn)Fas單克隆抗體在體內(nèi)體處與Fas結(jié)合后均能導(dǎo)致表達Fas的細胞發(fā)生凋亡，從而證明Fas是一種識別Fas配體，并將凋亡信息傳遞給細胞的細胞表面受體，故Fas基因又稱“凋亡基因”。Bax基因?qū)儆赽cl-2基因家族成員，其功能與bcl-2基因相反，為促凋亡基因，bax蛋白可與bcl-2蛋白形成異源二聚體，從而抑制bcl-2基因的抗凋亡作用。我們的實驗中正常的皮膚組織部分基底細胞bcl-2基因呈陽性反應(yīng)，這與國外學(xué)者的報道相符合，有文獻報道這些陽性細胞為黑素細胞，正常表皮中黑素細胞與基底角質(zhì)形成細胞的比例為1：30，提示黑素細胞死亡和再生的控制是非常嚴格的。黑素細胞bcl-2基因強陽性表達，這可能與保護它們避免受內(nèi)外環(huán)境的影響如紫外線的照射，減少凋亡有很大關(guān)系。在銀屑病中除黑素細胞和浸潤的淋巴細胞為陽性外，表皮增生的角質(zhì)形成細胞均為陰性，這提示bcl-2基因可能在銀屑病中所起的作用不大。目前認為在這類丘疹鱗屑性疾病中主要是bcl-X基因起作用。Wrone-Smith等及Foreman等發(fā)現(xiàn)銀bcl-X1基因在增生的角質(zhì)形成細胞上呈強陽性表達，認為bcl-X1基因可能通過抑制表皮細胞上呈強陽性表達，認為bcl-X1基因可能通過抑制表皮細胞凋亡，從而延長細胞的存活期。而本實驗中銀屑病組織促凋亡基因Fas、bax均為廣泛性表達，這與國外學(xué)者的結(jié)論一致。因此，我們認為在銀屑病中促凋亡基因Fas、bax起重要作用，而抑凋亡基因bcl-2作用可能不大