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自Tully[1]等1981年首次從非淋菌性尿道炎男性患者的尿道分泌物中分離培養(yǎng)出2株生殖原體（Mycoplasmagenitalun,Mg）以后，許多學(xué)者對Mg的生長特性、免疫學(xué)特性、分子生物學(xué)特性以及與疾病的關(guān)系等進(jìn)行了大量的研究并建立了多種Mg的檢測方法，本文就Mg的檢測方法研究進(jìn)展進(jìn)行簡要綜述。

1分離培養(yǎng)法

1.1培養(yǎng)基培養(yǎng)[1,2]Mg對培養(yǎng)基要求極高且生長緩慢,培養(yǎng)較難,尤其是臨床標(biāo)本中Mg的培養(yǎng)更不容易成功.Tully1981年建立了對醫(yī)學(xué)支原體具有重要意義的SP-4培養(yǎng)基.適合于Mg生長的SP-4培養(yǎng)基,不含醋酸鉈,含Mg代謝所需的葡萄糖及其它營養(yǎng)成份,最適pH為7.4-7.5,可通過加入0.8%Noble瓊脂或0.50.6%瓊脂而固體化,用于克隆菌株,觀察菌落,Tully等利用這種培養(yǎng)基,從13份尿道分泌物標(biāo)本中分離培養(yǎng)獲得2株Mg,培養(yǎng)期約為50天.1996年Jensen等還報道了另一種適合Mg生長的培養(yǎng)基，即改良Friis肉湯培養(yǎng)基，11份PCR檢測Mg-DNA陽性的尿道分泌物標(biāo)本中，有6份在其中呈陽性生長。

國內(nèi)學(xué)者對SP-4培養(yǎng)基進(jìn)行了改良。趙季文等[4]利用改良的SP-4培基從性病及性亂人群中分離Mg獲得成功，初代生長時間在30天以上，平均為37.83天，最長為55天。

1.2組織細(xì)胞培養(yǎng)法組織細(xì)胞培養(yǎng)支原體，可為支原體提供良好的類似體內(nèi)的生長環(huán)境。早在60年代，Chanock等[5]報道了肺炎支原體（Mp）在組織細(xì)胞中的生長。90年代，Jensen等[3，6]開始嘗試用細(xì)胞培養(yǎng)法來進(jìn)行Mg的繁殖，并借此在電鏡下觀察到Mg侵入細(xì)胞的過程以及在細(xì)胞內(nèi)的定位。在PCR的監(jiān)測下，Jensec發(fā)現(xiàn)在11分PCR檢測MgDNA陽性的尿道標(biāo)本中，有9份適應(yīng)在Vero細(xì)胞磁頭中增殖，經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入改良的FriisfF肉湯培養(yǎng)基中，有6份能繼續(xù)傳代生長，最終在瓊脂培養(yǎng)基中克隆獲得4株。Jensen認(rèn)為，在分離獲得新的Mg菌株方面，細(xì)胞培養(yǎng)繁殖過程起到了三方面的作用，一是使臨床標(biāo)本中的Mg逐漸適應(yīng)在人工培養(yǎng)基中生長，二是增加了接種于支原體肉湯培養(yǎng)基中的支原體數(shù)量，三是提供持續(xù)的接種源。

2血清學(xué)方法

根據(jù)Mg的免疫學(xué)特性，人們建立了用檢測Mg抗體和檢測與鑒定Mg抗原的血清學(xué)方法。

Furr等[7]于1984年詳細(xì)報道了檢測Mg抗體的MIF技術(shù)。Moller等對31例未檢測出Ct和Mh血清抗體的急性盆腔炎患者，用MIF檢測Mg抗體，發(fā)現(xiàn)其中大約40%在發(fā)病后一個月內(nèi)抗體滴度有4倍或4倍以上的改變。Taylor-Robinson等[9]報道應(yīng)用間接MIF檢測NGU患者M(jìn)g抗體，認(rèn)為間接MIF試驗是一種具有足夠敏感性、特異性和簡便易行的檢測方法。Jensen等曾用EIA檢測有尿道炎癥與無尿道炎癥狀的男性STD患者急性期血樣標(biāo)本中Mg抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反應(yīng)性較弱，且與Mp存在廣泛的交叉反應(yīng)。

根據(jù)特異性抗體能阻止支原體的生長及代謝這一特性，可采用已知高價血涉及進(jìn)行祖先生長及代謝抑制試驗以鑒別支原體[11]。趙季文等曾采用MIT鑒定所分離獲得的Mg菌株。

暴露于支原體表面的脂結(jié)合膜蛋白（lipid-associatedmembraneproteins,LAMPs是一種支原體種屬特異性抗原，具有高抗原性，且不同菌株的支原體，其LAMP抗體具有高度種屬特異性，與其它種屬無交叉反應(yīng)[12，13]。）因此提取Mg的LAMP建立ELISA方法檢測Mg抗體，可消除Mg與Mp之間的交叉反應(yīng)。

3分子生物學(xué)方法

DNA探針和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測Mg的方法，克服了前兩類檢測方法的弊端，為研究Mg與疾病的病因?qū)W關(guān)系提供了有力的手段。

3.1DNA探針技術(shù)1987年Hyman[14]用PUCB載體構(gòu)建成Mg基因文庫，并從中篩選制備出特異性DNA探針，通過斑點雜交，可檢測僅含0.1ng的特異性支原體DNA，即105CFU。

3.2聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)PCR是一種新的基因診斷技術(shù)，靈敏度高，特異性強(qiáng)，且快速、簡便。1990年，PCR技術(shù)開始在醫(yī)學(xué)支原領(lǐng)域應(yīng)用。

早期的引物多參照菌體末端特異性粘附蛋白的DNA序列而設(shè)計。Palmer等體外擴(kuò)增Mg粘附蛋白的部分核苷酸序列，3株Mg均出現(xiàn)37bp的DN斷，并證明PCR技術(shù)可檢測到10-15g的mg-DNA，其引物序列的：

mg1:5’TGTCTATGACCAGTATGTAC3’

mg2:5’CTGCTTTGGTCAAGACATCA3’

1991年Jensen等[16]根據(jù)Mg的粘附蛋白基因設(shè)計合成了如下組引物：

mgPa-15’AGATGATGAAACCCTAACCCCTTGG3’

mgPa-15’GACCATCAAGGTATTTCTCAACAGC3’

mgPa-15’CCGAGGGGTTTTCCATTTTTGC3’

用MgPa-1和MgPa-3成功地擴(kuò)增出Mg的281bpDN段，5個臨床分離株擴(kuò)增出同樣的產(chǎn)生，而其他支原體和細(xì)菌均為陰性，用MgPa-2作探針，對擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SoutherneP印跡雜交，均為陽性，證明引物具有特異性，共檢出下降大約有50個Mg細(xì)胞。1993年Jensen等[17]又根據(jù)Mg粘膜蛋白基因設(shè)計了另一對引物，即：

mg粘附蛋白基因設(shè)計了另一對引物，即：

mgPa-476：5‘ATGGCGAGCCTATCTTTGATCCTTTAA3’

mgPa-903：5‘TTCACCTCCCCACTACTGTCCTAATGC3’

用來證實和補(bǔ)充引物MgPa-1和MgPa-3所擴(kuò)增的結(jié)果，其擴(kuò)增片段為453bp。研究發(fā)現(xiàn)，這兩對Mg粘附蛋白引物的敏感性完全一致。用這種方法檢測99例尿道炎病人的尿道拭子，結(jié)果17例Mg陽性，而用培養(yǎng)法無一例陽性。

1994年Jensen[18]擴(kuò)增Mg粘附蛋白基因序列并測序表明：該序列在Mg條件之間有明顯異質(zhì)性，為此，Jensen等學(xué)者根據(jù)原體屬性高度保守區(qū)域16SrRNA的基因序列，設(shè)計了種特異性PCR引物，以期檢測臨床標(biāo)本中所有Mg的感染：其引物序列為：

Mg-1，5‘GAATGACTCTAGCAGGCAATGGCTG3’

Mg-2，5’ATTTGCTGCTCACTTTTACAAGTTGGCT3‘

4種臨床標(biāo)本的實驗結(jié)果表明，Mg粘附蛋白的基因序列不相同，但其165rRN基因序列則是100%同源，將兩種引物PCR結(jié)合，還可在可疑陽性標(biāo)本中檢測出10-50個Mg基因拷貝以下的Mg基因，即以16SrRNA基因為靶基因的PCR系統(tǒng)在保證長期特異性基礎(chǔ)上更為靈敏。

趙季文等[19]采用Palmer設(shè)計的引物，擴(kuò)增mg37bpDN段，檢測三種人群的Mg，結(jié)果是性亂人群陽性率為25.26%，性病人群為12.33%，而健康人群為3.85%。孔繁榮等[20]采用Jensen設(shè)計的MgPa-1和MgPa-3，擴(kuò)增Mg281bpDN段，檢測結(jié)果是性亂婦女Mg檢出率為10.2%，STD患者為4.0%。

1998年，糜祖煌等[2]研究報道了分別以Mg粘附蛋白和16rRNA基因為靶基因建立的二種套式PCR檢測技術(shù)，前者擴(kuò)增生Mg的374bpDN段，后者擴(kuò)增產(chǎn)生241bpDN段。套式PCR不僅提高了靈敏度，而且因采用兩對不同的引物，特性也進(jìn)一步的得到提高。用這些法檢測40例女性STD患者，發(fā)現(xiàn)Mg陽性12例，陽性率30%，檢出陽性率均高于普通PCR法。

4小結(jié)

微生物感染診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”是培養(yǎng)法，然而Mg培養(yǎng)成功率極低，有待于對培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步的研究和改良，以促進(jìn)Mg在其中的生長；此外，將細(xì)胞株引入Mg的培養(yǎng)可能是一個較好的方法，有必要加強(qiáng)這方面的探索和研究。免疫學(xué)檢測方法因支原體種屬間易出現(xiàn)交叉反應(yīng)以及對抗原、抗體純度要求較高而在實際應(yīng)用上受到一定限制，若能研究建立快速、靈敏、特異的檢測臨床標(biāo)本中Mg抗原的方法，則具有較大的實用價值。PCR技術(shù)是一個簡單而又直接的檢測Mg方法，正被日益廣泛地采用，主要用于Mg感染的早期診斷或急性感染的診斷及各種人群中Mg的流行病學(xué)研究。但在應(yīng)用時應(yīng)注意：①臨床標(biāo)本中Mg含量低，DNA純度不夠，抑制物過多，TaqDNA聚合酶活性低均會引起假陰性，應(yīng)進(jìn)一步完善模板DNA的提取技術(shù)；②因PCR靈敏度極高，在整個操作過程中均應(yīng)嚴(yán)格避免PCR產(chǎn)物的污染，以減少假陽性。

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