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胃蛋白酶范文第1篇

[關(guān)鍵詞]胃蛋白酶原；胃部疾病；臨床應(yīng)用

胃粘膜分泌的胃蛋白酶原1%通過胃粘膜毛細(xì)血管進(jìn)入血液循環(huán)，當(dāng)胃粘膜發(fā)生病變，血清中胃蛋白酶原的水平也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。所以檢測(cè)血清中胃蛋白酶遠(yuǎn)的表達(dá)水平對(duì)監(jiān)測(cè)胃粘膜形態(tài)及功能變化有一定意義。

MerinoAM等檢測(cè)了268例不同腫瘤患者的腫瘤組織中PGII的原位表達(dá)[1]，發(fā)現(xiàn)除在胃腸組織中表達(dá)外，PGII還表達(dá)于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等癌組織。從而證實(shí)PGII在胃腸外癌組織中的廣泛表達(dá)，而它與腫瘤發(fā)展的關(guān)系也逐漸被揭示。

日本、芬蘭將胃蛋白酶原作為早篩指標(biāo)取得了成果，減少了胃癌發(fā)病率，近年來國內(nèi)對(duì)胃蛋白酶原臨床應(yīng)用的研究也在不斷開展。本文就目前國內(nèi)外胃蛋白酶原臨床應(yīng)用的進(jìn)展情況進(jìn)行綜述。

1PG的生理

1.1PG的分類

胃蛋白酶原（PG）是一種具有消化功能的內(nèi)切蛋白酶前體，屬于天冬氨酸蛋白水解酶，是由375個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，其分子量為42KD，在酸性條件下被激活[2]。人胃蛋白酶原可分為兩種生化特征和免疫活性不同的胃蛋白酶原亞群：按胃蛋白酶原在瓊脂凝膠電泳下的遷移率由快至慢分為PGl-PG7七種同工酶原，其中PGl-PG5有共同的免疫原性，合稱PGI（又稱PGA）；PG6和PG7遷移率較慢，合稱PGII（又稱PGC）[3]。

1.2PG的分泌部位與分布。

PGI和PGII在細(xì)胞來源及組織內(nèi)分布各不相同[4-6]，PGI來源由于胃底腺的主細(xì)胞和頸粘液細(xì)胞分泌，PGII則由全胃腺和遠(yuǎn)端十二指腸Brunner氏腺分泌，前列腺和胰腺也產(chǎn)生少量PGII，胃粘膜合成的PGII約為總量的25%。只有少量（約1%）PG透過胃粘膜毛細(xì)血管進(jìn)入血循環(huán)，血清胃蛋白酶原的濃度可反應(yīng)胃粘膜的分泌水平，也可反應(yīng)不同部位胃粘膜的形態(tài)和功能。血清中具有PGI和PGII兩種形式。在尿中也有PG，但主要為PGI。中也有PG的分布，但只有PGII。PGI在胚胎胃粘膜中高度表達(dá)，在胃中幼稚細(xì)胞即能分泌一定量的PGI，而PGII最初出現(xiàn)在胚胎后期，約胚胎的第32~36周，是胃粘膜細(xì)胞分化成熟，消化功能逐漸完善的標(biāo)志。不同種的PG的產(chǎn)生似乎與以下幾種因素相關(guān)：結(jié)構(gòu)基因的數(shù)量、個(gè)體等位基因的差異及翻譯后的修飾[7]。PG連續(xù)分泌的最大速率是由其最大合成速率決定的，PG的合成是一個(gè)獨(dú)立連續(xù)的使得消化細(xì)胞充滿顆粒的過程，溢出性分泌是PG分泌的唯一的而且是最基本的形式[8]。

2PG的臨床應(yīng)用

2.1用于胃癌的早期篩查

日本Kitahara等早在1999年以PGI、PGII加胃鏡活檢普查了5113人[9]，以血清PGI

2.2作為胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的判定指標(biāo)

胃癌患者全胃切除后血清PG含量作為隨訪指標(biāo)，可為胃癌復(fù)發(fā)提供重要線索。林惠忠等測(cè)定了62例胃癌患者和61例健康人的血清PG[15]，發(fā)現(xiàn)胃癌患者PG水平明顯低于健康人的PG水平，且在早期胃癌即發(fā)生改變，進(jìn)展期胃癌則更低。進(jìn)一步測(cè)定術(shù)后患者血清PG，發(fā)現(xiàn)手術(shù)后PG較術(shù)前明顯降低。跟蹤隨訪后發(fā)現(xiàn)在部分胃切除患者胃癌復(fù)發(fā)后血清PG無明顯變化，而全胃切除患者胃癌復(fù)發(fā)后PG顯著升高。從而證實(shí)血清中PG，尤其是PGI、PGI/PGII是監(jiān)測(cè)全胃切除術(shù)后復(fù)發(fā)的良好指標(biāo)。

2.3用于腸膽反流的診斷

張立魁認(rèn)為少量的未被活化的胃蛋白酶原經(jīng)門靜脈血液再分泌或直接進(jìn)入膽道[16]，從而可以在膽汁中檢測(cè)到。故以核素判斷腸膽反流為基礎(chǔ)，分析胃蛋白酶原法診斷腸膽反流的可行性。結(jié)果，在反流組患者膽汁中PGⅡ的質(zhì)量濃度低于無反流組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為其PGⅡ質(zhì)量濃度低于無反流組是因?yàn)槲杆岱戳鬟M(jìn)入膽道，從而分解了胃蛋白酶原。同時(shí)參照應(yīng)用淀粉酶值判斷胰膽反流的方法[17]，取PGⅡ26.45μg/L作為判斷“T”管引流患者有無腸膽反流的界值，膽汁中PGⅡ質(zhì)量濃度低于26.45μg/L則認(rèn)為存在反流。認(rèn)為使用胃蛋白酶原Ⅱ法判斷腸膽反流的陽性率（27.59%）低于核素法（37.93%），操作較為繁雜，不如口服核素法直觀，且可靠性稍差，但患者避免暴露于放射性輻射的可能，無痛苦，可以作為觀察十二指腸膽道反流的一種選擇方法。

2.4作為胃腸外疾病的監(jiān)測(cè)手段

2.4.1卵巢癌

RojoJV，MerinoAM等檢測(cè)了72例上皮細(xì)胞卵巢癌患者癌組織中PGII的表達(dá)[18]，發(fā)現(xiàn)19例PGII表達(dá)陽性，與臨床病理特點(diǎn)無明顯相關(guān)性，而在血清CA125水平低于35U/ml的PGII陽性患者比其他患者有一個(gè)較好的預(yù)后。

2.4.2前列腺癌

DiazM，RodriguezJC等研究了24例接受抗雄激素治療伴有骨轉(zhuǎn)移的原發(fā)性前列腺癌患者的組織PGII表達(dá)[19]，其中12例（42.8%）PGII表達(dá)陽性，進(jìn)一步調(diào)查預(yù)后發(fā)現(xiàn)PGII的表達(dá)與長期預(yù)后有顯著相關(guān)性。從而得出結(jié)論P(yáng)GII可以作為一個(gè)有用的激素相關(guān)性前列腺癌預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記。

2.4.3乳腺癌

VizosoF，SanchzLM等測(cè)定了243例乳腺癌患者腫瘤組織中胃蛋白酶原的表達(dá)[20]，其中113例表達(dá)陽性，且高分化的癌組織PGII表達(dá)顯著高于低分化的癌組織。經(jīng)過48.5月的預(yù)后調(diào)查發(fā)現(xiàn)癌組織中PGII的低表達(dá)預(yù)示著良好的無復(fù)發(fā)預(yù)后和整體預(yù)后，從而得出結(jié)論P(yáng)GII的表達(dá)較低可以提示患者的早期復(fù)發(fā)和不良的預(yù)后。

2.4.5葡萄膜黑色素瘤

AlvarezML等研究了22葡萄膜黑色素瘤組織中PGII的表達(dá)[21]，其中11例PGII表達(dá)陽性，其在伴有鞏膜侵犯的患者組織中的PGII表達(dá)陽性的幾率高于無鞏膜侵犯者，PGII的表達(dá)與較差的預(yù)后有顯著的相關(guān)性。

3小結(jié)：

綜上所述，現(xiàn)今胃蛋白酶原研究主要集中于將其用于胃癌前期病變的早期篩查。此種血清學(xué)檢測(cè)是更為簡便、經(jīng)濟(jì)、安全、和有效的方法，已逐漸被接受為一種篩查方法，但目前很多臨床研究測(cè)定其篩查界值結(jié)果各異，雖然作為胃癌篩查指標(biāo)目前應(yīng)用較多的界值為PGI

胃蛋白酶原與胃腸疾病、胃腸疾病外其它疾病的相關(guān)性也有一定的研究，但目前尚不成熟。隨著胃蛋白酶原檢測(cè)方法的進(jìn)步及不同胃部疾病胃蛋白酶原表達(dá)情況的深入研究，有待于進(jìn)一步探討不同胃部疾病及胃部疾病的不同證型患者胃蛋白酶原的表達(dá)情況，并界定最佳界值，以其使胃蛋白酶原不僅僅用于胃癌的早期篩查，而是進(jìn)一步用于胃部疾病的診斷，并通過胃蛋白酶原水平判斷胃部疾病的具體病變部位。

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胃蛋白酶范文第2篇

[關(guān)鍵詞] 慢性胃部病變；血清胃蛋白酶原；變化；糜爛性胃炎

[中圖分類號(hào)] R573 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2017）09-211-04

Clinical study on changes of serum pepsinogen in patients with chronic gastric diseases

WANG Mingnan HUANG Deqiu WU Shaolin OU Yongguang XIE Xinkun

Department of Laboratory， Zhaoqing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Zhaoqing 526020， China

[Abstract] Objective To discuss changes of serum pepsinogen in patients with chronic gastric diseases. Methods 216 cases with chronic gastric diseases from Jan 2014 to Dec 2016 were selected as subjects， among them， 54 cases of superficial gastritis， 30 cases of erosive gastritis， 44 cases of atrophic gastritis， 36 cases of gastric ulcer， 40 cases of duodenal ulcer， 12 cases of gastric cancer. PGⅠ， PGⅡ and PGⅠ/ PGⅡ levels of difference groups were compared， and PGⅠ， PGⅡ and PGⅠ/ PGⅡ levels of Hp+ and Hp- patients were compared. Results PGⅠ levels of erosive gastritis， gastric ulcer， duodenal ulcer were higher than those of control group， and atrophic gastritis and gastric cancer was lower than those of control group， which showed significant difference（P

胃蛋白酶范文第3篇

【關(guān)鍵詞】 小兒增食靈合劑；胃蛋白酶；胃酸：小兒厭食癥

小兒厭食癥是指食欲減退的一種慢性食欲障礙性疾病，多發(fā)于1～6歲小兒，城市發(fā)病率高于農(nóng)村，近年來發(fā)病率有增高趨勢(shì)。以我科張士卿教授治療小兒厭食癥的經(jīng)驗(yàn)方組方加減的小兒增食靈合劑，通過多年臨床觀察，具有可靠療效。為探討其作用機(jī)制，筆者研究了小兒增食靈合劑對(duì)厭食癥模型大鼠胃蛋白酶活性和胃酸分泌量的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 藥物及試劑

小兒增食靈合劑由甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供，規(guī)格：240 mL/瓶；批號(hào)：200506；臨用時(shí)按14.4 g/(kg·d)、7.2 g/(kg·d)分別用蒸餾水配制成相應(yīng)的水溶液。江中健胃消食片：江中搖曳股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)0404003，臨用時(shí)用蒸餾水制成混懸液，0.576 g/(kg·d)(2 mL)。試劑主要有乙醚、氫氧化鈉、鹽酸、酚酞、二甲基黃指示劑。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選斷乳后1周齡的健康SD大鼠50只（甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），質(zhì)量（60±10）g，雌雄各半。合格證書：SCXK（甘）2004－007－0001515。

2方法

2.1動(dòng)物分組

將50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，依據(jù)數(shù)字隨機(jī)表法分為5組，每組10只。A組：空白對(duì)照組。B組：模型對(duì)照組。C組：陽性對(duì)照組。D組：小兒增食靈合劑小劑量組，簡稱小劑量組。E組：小兒增食靈合劑大劑量組，簡稱大劑量組。

2.2模型的建立與給藥

所有動(dòng)物在同一條件下喂養(yǎng)（室溫20~24 ℃，相對(duì)濕度50 % ）。 A組以常規(guī)飼料喂養(yǎng)，其余4組用特制飼料喂養(yǎng)。特制飼料采用魚肉松、奶粉、玉米粉、黃豆粉、白糖、鮮雞蛋、鮮肥肉按照1∶1∶1∶2∶1∶1.8∶2比例混勻［1］ ，捏成餅干狀，每塊約20 g，晾干，4 ℃冷藏備用。所有動(dòng)物均單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，共飼養(yǎng)5周。每日記錄進(jìn)食量及身體質(zhì)量的變化，以造模大鼠攝食量平均下降20 %~30 %為模型成功標(biāo)準(zhǔn),或身體質(zhì)量低于對(duì)照組10 %~15 %為造模成功［2］ 。造模成功1周后，各組開始灌胃。A組和B組每日灌服等體積蒸餾水，D組和E組灌服相應(yīng)劑量的小兒增食靈合劑水溶液2 mL，C組每日灌服江中健胃消食片混懸液2 mL。各組大鼠均每日灌胃1次，連續(xù)灌胃15 d。

2.3標(biāo)本的采集

所有大鼠禁食禁水48 h，用乙醚麻醉大鼠，備皮，常規(guī)消毒皮膚，于劍突下沿腹白線開一2.5 cm切口，提起胃，在幽門與十二指腸結(jié)合部用縫線結(jié)扎。各組分別于十二指腸注入生理鹽水，劑量為0.01 mL/g。縫合創(chuàng)口后放回籠中，術(shù)后禁食禁水，5 h后斷頸處死動(dòng)物，取出胃，收集胃液于刻度離心管，以2500 r/min離心15 min，吸取上清液進(jìn)行胃液分析［3］ 。

2.4檢測(cè)方法［4-6］

2.4.1大鼠胃蛋白酶活性的檢測(cè)

采用Mett法測(cè)定胃蛋白酶活性。先用內(nèi)徑2 mm、長10 cm的毛細(xì)玻璃管吸滿雞蛋清（紗布過濾），然后放于70 ℃熱水中使蛋白凝固，制成蛋白管取出備用（實(shí)驗(yàn)當(dāng)天制備）。準(zhǔn)確吸取胃上清液1 mL于試管中，并加入15 mL的鹽酸（0.05 mol/L），放進(jìn)兩根蛋白管作為平行樣。試管封口后放進(jìn)37 ℃恒溫箱保存，24 h取出兩根蛋白管，測(cè)量其四端透明部分的長度（mm），求平均值。公式如下：

胃蛋白酶活性單位（U/mL）=四端蛋白管透明部分長度均值2×16

2.4.2大鼠胃酸分泌量的測(cè)定

取清晰胃液2 mL，置于小燒杯中，加入二甲基黃指示劑和酚酞指示劑各3滴，混勻，呈櫻紅色，于小燒杯下襯一白紙。用微量滴定管徐徐滴入0.02 mmol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液，隨滴隨搖，直至櫻紅色消失，開始出現(xiàn)橙黃色時(shí)，記錄NaOH溶液的消耗量，即為游離酸度終點(diǎn)量，繼續(xù)用0.02 mmol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，至出現(xiàn)酚酞的紅色（微紅色不退），記錄NaOH溶液的消耗量與上所用之和即為總酸度終點(diǎn)量，按下式計(jì)算游離酸和總酸度：

游離酸（mmol/L）=游離酸度終點(diǎn)量×10

總酸度(mmol/L)=總酸度終點(diǎn)量×10

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理，各指標(biāo)組間根據(jù)方差齊性采用多因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠攝食量變化比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，造模第1～7 d，B組大鼠日平均進(jìn)食量低于A組20.1 %左右，第7～21 d，B組大鼠日平均進(jìn)食量低于A組24.5 %，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均有顯著性差異。見表1。

表1各組大鼠日平均進(jìn)食量比較 （±s，g）組別n第1 d第7 d第14 d第21 d第27 d第33 d A106.80±1.1311.90±1.6914.99±1.6715.38±1.2115.37±1.3415.60±1.49 B106.78±0.789.54±0.8811.20±0.9511.58±0.9511.13±1.7711.36±0.70 C106.16±0.949.51±0.6511.12±1.0112.57±0.9313.82±0.5514.35±0.62 D106.10±0.609.46±0.9511.06±0.6012.60±1.0614.08±1.0315.04±1.28 E106.29±0.949.50±1.1711.49±0.8212.36±1.3914.10±0.4914.45±1.35 注：與A組比較 P?0.05 ,P?0.01；與B組比較 P?0.05, P?0.01

3.2小兒增食靈合劑對(duì)胃蛋白酶活性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大、小劑量小兒增食靈合劑及江中健胃消食片水溶劑均具有提高胃蛋白酶活性的作用，與A、B兩組比較，有非常顯著性差異（P?0.01 ）。但D、E兩組與C組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

3.3小兒增食靈合劑對(duì)胃酸分泌量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大、小劑量小兒增食靈合劑及江中健胃消食片水溶劑均可使胃游離酸和胃總酸分泌量增加，尤其可顯著提高胃游離酸；與A組比較，P<0.05或P<0.01；與B組比較，P<0.01；但D、E組與C組組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表2小兒??食靈合劑對(duì)胃蛋白酶

活性的影響 （±s）組別n胃蛋白酶活性

（U）A組10855.25±249.14B組10642.00±126.02C組101565.00±321.72D組101750.25±472.80E組102082.75±446.23 注：與A組比較P?0.01；與B組比較P?0.01表3小兒??食靈合劑對(duì)胃游離酸和

總酸度的影響 （±s）

組別n游離酸度

（mmol/L）總酸度

（mmol/L）A組1034.61±3.0864.29±9.52B組1033.06±6.6262.86±13.35C組1043.57±4.65 75.50±3.80D組1042.52±5.0875.38±2.39E組1045.73±3.2376.46±5.24 注：與A組比較P?0.05， P?0.01；與B組比較P?0.01

4討論

導(dǎo)致小兒厭食癥發(fā)病的病因較多，但大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與脾胃失調(diào)、納化失常有關(guān)。因此，治療本病關(guān)鍵在于運(yùn)脾和胃。小兒增食靈合劑是張士卿教授將厭食癥機(jī)理與“脾健不在補(bǔ)而貴在運(yùn)”的指導(dǎo)思想相結(jié)合，經(jīng)過多年臨床應(yīng)用創(chuàng)制而成的。組方中蒼術(shù)味微苦，芳香悅胃，功能醒脾助運(yùn)、開郁寬中、疏化水濕，正合脾之習(xí)性，故為君藥；茯苓性平，作用和緩，可健脾補(bǔ)中，與蒼術(shù)相配燥濕而不傷脾，補(bǔ)脾而不斂濕，又補(bǔ)中有運(yùn)，補(bǔ)運(yùn)結(jié)合；檳榔、雞內(nèi)金可行氣和胃，消食化積；胡黃連善清胃腸濕熱；烏梅酸收，可益氣開胃，與胡黃連配伍又可助其除疳清熱之功；炙甘草益氣補(bǔ)中，調(diào)和諸藥。上述諸藥合用，可謂消補(bǔ)并舉，標(biāo)本同治，補(bǔ)而不滯，消導(dǎo)而不傷正，共奏健脾助運(yùn)、消食醒胃、行氣消積之功。

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胃蛋白酶范文第4篇

關(guān)鍵詞：微生物；彈性蛋白酶；發(fā)酵

中圖分類號(hào)：Q556+.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1672-979X(2007)01-0050-04

Progress in Microbial Production of Elastase

FANG Shang-ling, HU Jia-jun

（College of Biochemical Engineering, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China）

彈性蛋白酶（elastase）是一種以分解不溶性彈性蛋白質(zhì)為特征的廣譜蛋白水解酶，主要存在于動(dòng)物胰臟中，以及皮膚、主動(dòng)脈、血小板和白血球中。在微生物類群中也廣有分布，細(xì)菌、放線菌、真菌中都有分泌胞外彈性蛋白酶的報(bào)道[1]。彈性蛋白酶可由動(dòng)物胰臟提取或由微生物發(fā)酵制得[2]。由動(dòng)物提取純化的彈性蛋白酶是一種肽鏈內(nèi)切酶，由240個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量為25 900，等電點(diǎn)為pI 9.5[3]。來源不同的微生物彈性蛋白酶都能降解其天然底物――彈性硬蛋白質(zhì)。同功不同源蛋白酶的特點(diǎn)、性質(zhì)、相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等有所差異，但都是一種廣譜的肽鏈內(nèi)切酶，具有較廣泛的水解特性[4]。

目前，彈性蛋白酶主要作為治療高脂血癥、防治動(dòng)脈粥樣硬化癥的生化藥物，治療確切，安全可靠。我國生產(chǎn)彈性蛋白酶主要由豬胰臟提取，原料來源有限制，且酶含量不高，每1 kg鮮胰臟含彈性蛋白酶僅210 000 U，限制了生產(chǎn)的發(fā)展。微生物彈性蛋白酶與胰彈性蛋白酶一樣，具有較廣的水解特性，不但能降解彈性蛋白，而且能分解酪蛋白、明膠、血纖維蛋白、血紅蛋白、白蛋白等多種蛋白質(zhì)，是一種廣譜的肽鏈內(nèi)切酶。國外，藥用彈性蛋白酶有通過動(dòng)物胰臟提取，也有發(fā)酵生產(chǎn)，其效果相似[1]。利用微生物發(fā)酵大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)彈性蛋白酶不僅能提供足夠的治療用藥物酶，也能為開拓該酶其他方面的應(yīng)用提供充足的酶源。

1微生物來源彈性蛋白酶的國內(nèi)外研究情況

彈性蛋白酶最初是1949年由Balo等從胰臟中分離純化出來，并指出其含量水平與動(dòng)脈粥樣硬化癥有關(guān)。從此對(duì)該酶的研究一直很活躍。

1960年Mandl等從牙周病患者的送檢樣品中首次分離出產(chǎn)胞外彈性蛋白酶的微生物Flavobaterium clastdyticum，并從它的培養(yǎng)液中分離純化出專一降解彈性蛋白的菌源性彈性蛋白酶。此后從細(xì)菌、霉菌、放線菌中相繼分離出產(chǎn)酶菌株及其菌源彈性蛋白酶，但初期主要集中于醫(yī)學(xué)微生物病原學(xué)的研究。70年代中期以來，日本和前蘇聯(lián)學(xué)者對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)彈性蛋白酶進(jìn)行了大量的研究，并申報(bào)了許多專利菌種。其中研究比較詳盡的是銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa IFO3455）。另外，1974年，Shiio等從自然界取樣分離的Flavobacterium immotum 9-35具有很強(qiáng)的彈性蛋白酶分泌能力。后來分離出1株利福平抗性的高產(chǎn)突變株Flavobacterium R-102-87，在以葡萄糖、干酪素為營養(yǎng)源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，酶產(chǎn)量達(dá)145U/mL（40 ℃，20 min，使1.0 mg地衣紅-彈性蛋白質(zhì)完全溶解的酶量為1U）。

前蘇聯(lián)學(xué)者對(duì)放線菌屬和曲霉屬菌株產(chǎn)彈性蛋白酶研究較多。放線菌屬產(chǎn)彈性蛋白酶的代表菌株是Actinomyces rimosus和Actinomyces fradiae119。將Actinomyces rimosus所產(chǎn)的酶純化并與胰彈性酶比較，發(fā)現(xiàn)除相對(duì)分子質(zhì)量較大外，其它性質(zhì)及水解專一性都與胰源酶十分相似。

真菌中產(chǎn)彈性蛋白酶的高產(chǎn)菌株是曲霉屬，前蘇聯(lián)Parksrskyte等選出的彈性蛋白酶高產(chǎn)菌Aspergillus versicolor 837，在以硫酸銨為氮源的馬鈴薯汁培養(yǎng)基深層液體培養(yǎng)48 h，然后強(qiáng)烈通風(fēng)培養(yǎng)4 d，培養(yǎng)液積聚大量胞外彈性蛋白酶。

我國對(duì)微生物產(chǎn)彈性蛋白酶的研究則少見文獻(xiàn)報(bào)道，直到上世紀(jì)90年代才有顏?zhàn)臃f等[5]關(guān)于芳香黃桿菌產(chǎn)彈性蛋白酶菌種篩選、發(fā)酵條件研究及酶分離純化等方面的報(bào)道。他們分離的黃桿菌Flavobacterium sp.17-87在30℃，搖瓶培養(yǎng)24 h，彈性蛋白酶產(chǎn)量達(dá)120 U/mL，并從中成功地分離出了黃桿菌彈性蛋白酶結(jié)晶。

隨后，曹軍等[6]從不同省區(qū)采集的500多個(gè)土樣中分離得到多株產(chǎn)彈性蛋白酶菌株，主要集中在黃桿菌屬和色桿菌屬中。經(jīng)細(xì)胞工程技術(shù)處理后，黃桿菌屬中F-122菌搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶能力達(dá)到240 U/mL，活力比原始菌株提高了58%。

陳啟和等[7]從土壤中也篩選到一株高產(chǎn)彈性蛋白酶的芽孢桿菌（EL3），其酶活達(dá)100 U/mL。經(jīng)過誘變選育、培養(yǎng)基優(yōu)化等系列研究，獲得了大幅度提高酶活性的培養(yǎng)條件。陳麗娟等[8]對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)彈性酶及提純工藝進(jìn)行了較為深入的研究。王娟麗等[9]從土壤中篩選了一株彈性蛋白酶高產(chǎn)菌株Bacillus pseudofirmus EL112，酶活性也達(dá)100 U/mL。據(jù)hiio等報(bào)道，產(chǎn)酶活性達(dá)155 U/mL，具備了工業(yè)化生產(chǎn)價(jià)值。

2微生物產(chǎn)彈性蛋白酶的特征

微生物產(chǎn)生的彈性蛋白酶在結(jié)構(gòu)特征上，具有2個(gè)標(biāo)志性特征：（1）與彈性蛋白質(zhì)有高親和力；（2）酶切位點(diǎn)在脂肪族氨基酸羧基參與形成的肽鍵上。雖然不同來源的彈性蛋白酶的特點(diǎn)、性質(zhì)、相對(duì)分子質(zhì)量不盡相同，但迄今為止所有分離的彈性蛋白酶最適作用pH均在7.0以上，屬于堿性彈性蛋白酶，酸性彈性蛋白酶尚未見報(bào)道。與其它的堿性蛋白酶不同，堿性彈性蛋白酶對(duì)甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）殘基有很高的水解特異性。彈性蛋白中Ala、Gly含量高達(dá)55%。這也解釋了彈性蛋白酶能高效降解彈性蛋白質(zhì)的原因。

彈性蛋白酶的水解機(jī)制，是首先使彈性蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變疏松并溶解，然后將已溶解的彈性蛋白質(zhì)降解成可溶的多肽及氨基酸。彈性蛋白質(zhì)在堿性環(huán)境下易變性，結(jié)構(gòu)疏松，有利于彈性蛋白酶對(duì)其水解。從嗜堿菌中篩選得到的菌株所產(chǎn)彈性蛋白酶有較高的最適反應(yīng)pH，其降解彈性蛋白質(zhì)的酶活性也高。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的微生物產(chǎn)彈性蛋白酶根據(jù)等電點(diǎn)可分為2類：（1）等電點(diǎn)在堿性的彈性蛋白酶，其與底物之間的結(jié)合力主要為靜電作用力，如芽孢桿菌屬（Bacillus）、放線菌屬（Actinomyces）、黃桿菌屬（Flavobacterium）產(chǎn)的彈性蛋白酶。嗜堿芽孢桿菌Ya-B產(chǎn)的彈性蛋白酶幾乎所有正電荷殘基都集中在分子表面，這有利于該酶與彈性蛋白質(zhì)結(jié)合。當(dāng)pH高于彈性蛋白酶的等電點(diǎn)時(shí)，彈性蛋白酶失去邊面正電荷，與彈性蛋白質(zhì)的結(jié)合率顯著下降；（2）等電點(diǎn)在酸性的彈性蛋白酶，其與底物彈性蛋白質(zhì)之間的結(jié)合力主要為疏水作用力，NaCl不能抑制該酶的活性。如：銅綠假單胞菌產(chǎn)的彈性蛋白酶、人胰腺中的彈性蛋白酶、Myxococcus xanthus產(chǎn)的MAP1。Ca2+對(duì)保持酶活力，防止酶自身降解必不可少。Micrococcus luteus[8]產(chǎn)生的堿性彈性蛋白酶在Ca2+存在下，在pH6.0～10.5之間、57 ℃以下穩(wěn)定；EDTA可通過與Ca2+ 結(jié)合完全抑制酶活性并導(dǎo)致酶的自溶。

3微生物彈性蛋白酶的基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)展

3.1彈性蛋白酶的基因克隆和表達(dá)

采用分子生物學(xué)技術(shù)克隆目的基因構(gòu)建工程菌株，是各國微生物學(xué)家的研究熱點(diǎn)。彈性蛋白酶基因的克隆和表達(dá)，可從理論上解釋彈性蛋白酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)及酶學(xué)反應(yīng)機(jī)制，并為該酶實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。1987年，胰彈性蛋白酶的基因首次被克隆，并在E.coli LE392中表達(dá)成功[10]。Yoda等在E.coli-B.subtilis的穿梭載體pHY300pLK的基礎(chǔ)上，構(gòu)建含彈性蛋白酶基因的質(zhì)粒，將Bacillus的堿性彈性蛋白酶的基因克隆到B.subltils中得以表達(dá)。表達(dá)菌產(chǎn)酶為73 U/mL。

Ryuta 等于1989年克隆了嗜堿芽孢桿菌Ya-B的堿性彈性蛋白酶基因（ale）并測(cè)得其核苷酸序列，推出其氨基酸序列，從分子機(jī)制解釋彈性蛋白酶具有高的最適反應(yīng)pH及高酶活性的原因。該基因共編碼378個(gè)氨基酸，其中包含27個(gè)氨基酸的信號(hào)肽及83個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列，成熟酶蛋白由268個(gè)氨基酸組成。他們將該基因克隆到表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)化到E.coli K-12和B.subtilis DB104中，在后者中檢測(cè)到了目的基因的表達(dá)。

Chang等[11]深入研究了該酶的信號(hào)肽及前導(dǎo)序列的功能，將ale基因的信號(hào)肽及前導(dǎo)序列分別克隆表達(dá)。結(jié)果表明，彈性蛋白酶Ya-B的正確折疊形成有活性的蛋白酶的過程發(fā)生在細(xì)胞外，此過程需要分泌于胞外的前導(dǎo)序列的協(xié)助。Yeh等[12]將ale基因的起始密碼子UUG突變?yōu)镚UG，AUG，提高了ale在B.subtilis DB104及ale基因缺陷型突變株YaB-DEC中的表達(dá)。

黃春基等[13]用PCR擴(kuò)增及克隆銅綠假單胞菌的彈性蛋白酶基因。方法是從銅綠假單胞菌培養(yǎng)物中提取染色體DNA，PCR擴(kuò)增彈性蛋白酶基因成熟蛋白編碼區(qū)，A-T克隆于pMD18-T載體中，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。結(jié)果從高GC含量的銅綠假單胞菌染色體DNA中擴(kuò)增到彈性蛋白酶基因并進(jìn)行了克隆與鑒定，該研究實(shí)現(xiàn)了活性彈性蛋白酶的高效表達(dá)。

3.2蛋白質(zhì)工程改造彈性蛋白酶

Mei等[14]以枯草桿菌彈性蛋白酶BPN、枯草桿菌彈性蛋白酶Carlsberg為模板，用計(jì)算機(jī)構(gòu)建了elastase YaB的三維結(jié)構(gòu)模型。對(duì)位于S1底物結(jié)合口袋兩側(cè)的甘氨酸-124（Gly124）、甘氨酸-151（Gly151）定點(diǎn)突變，用帶有較大側(cè)鏈的堿基的結(jié)合切割。突變蛋白基因在Bacillus subtilis DB104中表達(dá)，突變蛋白G124A，G124V，G151A對(duì)相應(yīng)作用底物表現(xiàn)出比野生型高3～10倍的催化能力。同時(shí)，突變蛋白G124A、G124V的作用底物僅限于丙氨酸、甘氨酸，G151A僅限于丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸。

4微生物彈性蛋白酶的分離制備

微生物彈性蛋白酶是胞外酶，且等電點(diǎn)較高，分離純化較為容易，可用離子交換法提純。近來，也開始應(yīng)用親和吸附層析法[15]。

4.1離子交換法

森原和之等采用弱酸性陽離子交換樹脂直接吸附綠膿桿菌IFO 3455發(fā)酵液中的彈性蛋白酶，分離該酶并取得成功。Shiio等應(yīng)用類型法分別從產(chǎn)黃菌R-102-87和Actinomyces rimosus的發(fā)酵液中直接分離出彈性蛋白酶成分，從大體積發(fā)酵液中濃縮彈性蛋白酶組分十分理想，可達(dá)到分離和純化的目的。

4.2親和層析法

吳梧桐等以水不溶性彈性硬蛋白酶的天然底物作為親和吸附劑裝柱，應(yīng)用酶和底物的親和吸附力進(jìn)行分離提純，僅進(jìn)一步柱層析即獲得聚丙烯酰胺凝膠電泳均一的胰彈性蛋白酶制品。顏?zhàn)臃f等[15]在對(duì)產(chǎn)黃菌sp17-87的研究中，應(yīng)用該法分離出電泳均一純的彈性蛋白酶。以160目牛頸韌帶彈性蛋白質(zhì)作為親和吸附劑，纖維素粉為載體按1∶20混合裝柱，控制層析條件可使酶與底物結(jié)合而不分解底物，從而達(dá)到分離該酶的目的。

5微生物彈性蛋白酶的應(yīng)用

彈性蛋白酶的用途很廣，目前由于主要從臟器中提取，產(chǎn)量小，價(jià)格高，限制了其應(yīng)用。

彈性蛋白酶在醫(yī)藥方面主要作為治療藥物：（1）治療高脂血癥；（2）防治動(dòng)脈粥樣硬化；（3）抑制脂肪肝發(fā)展；（4）治療慢性氣管炎及其它結(jié)締組織纖維增生性疾病；（5）外用于消除皮膚焦痂、碎屑，用于燒傷患者的治療以及皮膚潰瘍、口腔潰瘍等癥。由于胰彈性蛋白酶和菌源彈性蛋白酶性質(zhì)有差別，雖然國外有報(bào)道菌源酶可替代胰源酶用作藥品，但具體涉及到某一屬菌株所產(chǎn)的酶，必須在藥理、毒理及藥效方面與胰源酶作充分的比較以確保療效及安全性。

彈性蛋白酶可用于食品工業(yè)。許多動(dòng)、植物蛋白質(zhì)，特別是一些難以處理和食用的韌帶、大動(dòng)脈血管、筋腱等蛋白質(zhì)廢料都可被其降解，因此在農(nóng)副產(chǎn)品深加工、高蛋白質(zhì)食品的制作、罐頭加工等方面將會(huì)得到廣泛應(yīng)用。

日用化學(xué)工業(yè)方面，彈性蛋白酶主要用于療效化妝品的生產(chǎn)。國外近年有報(bào)道將彈性蛋白酶加入化妝品，可增進(jìn)、改善皮膚血液循環(huán)，并改善皮膚脂質(zhì)代謝，增強(qiáng)皮膚、毛發(fā)的彈性、柔性，延緩皮膚老化，減少皺紋及色素沉著，還能促進(jìn)頭發(fā)生長，防止脫發(fā)。研究表明，對(duì)呈老化現(xiàn)象的皮膚施以含彈性蛋白酶的化妝品，可明顯的賦活皮膚細(xì)胞，皮膚角化程度減少，潤濕程度增加。同時(shí)，應(yīng)用廉價(jià)的微生物彈性蛋白酶將難以處理的動(dòng)物頸、背韌帶等廢料制成高級(jí)化妝品原料，將大大簡化工藝，減低成本，并變廢為寶，

綜上所述，應(yīng)用生物工程技術(shù)，將有可能提供充足的新酶源。在國外，已經(jīng)應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建工程菌生產(chǎn)彈性蛋白酶，胰彈性蛋白酶基因已被克隆并在大腸桿菌392中表達(dá)成功。選育合適的菌種應(yīng)用發(fā)酵技術(shù)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，具有很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

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胃蛋白酶范文第5篇

關(guān)鍵詞：彈性蛋白酶；枯草芽孢桿菌；分離；純化

中圖分類號(hào)：Q939.97文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1672-979X(2007)11-0040-03

Approach on Preparative Method of Elastase Produced by Microorganism

FANG Shang-ling, HU Jia- jun , ZHU Nan

（College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan 430068 ,China）

Abstract：Objective To investigate the preparative method of elastase produced by microorganism. Methods A elastase-producing strain of Bacillus subtilis was inoculated into fermentation medium and cultivated on a rotary shaker。The broth was collected by centrifugation. The purification of elastase was achieved by combination methods of (NH4)2S04 fractionation, anion exchange chromatography on DEAE-Sephadex A-25 and gel filtration chromatography on Sephadex G-75. Results Through the purification procedures shown above, the purification multiple of elastase was 33, the recovery rate was up to 12 % and the specific activity was about 528 U/mg.Conclusion The purer elastase can be obtained by this ideal purification technology.

Key words：elastase; Bacillus subtilis; separation; purification

彈性蛋白酶（elastase）是一種以降解不溶性彈性蛋白質(zhì)為特征的水解酶，此酶屬于絲 氨酸蛋白酶，可由動(dòng)物胰臟提取或由微生物發(fā)酵制得。從胰臟提取的彈性蛋白酶價(jià)格較高，因此，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)彈性蛋白酶具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。本研究以微生物發(fā)酵液為原料，采用鹽析、離子交換層析和凝膠過濾層析方法進(jìn)行彈性蛋白酶純化，并結(jié)合SDS-PAGE對(duì)純化酶進(jìn)行測(cè)定。

1材料

1.1菌種

彈性蛋白酶生產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌B1由本實(shí)驗(yàn)室篩選并分離。

1.2試劑

彈性蛋白、剛果紅-彈性蛋白（Sigma公司）；K2HPO4（上海恒信化學(xué)試劑有限公司）；DEAE-Sephadex A-25，Sephadex G-75（Pharmacia公司）。

1.3儀器

磁力攪拌器（江蘇岸頭分析儀器廠）；旋轉(zhuǎn)式搖床（中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠）；可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）；電熱干燥箱（江蘇海門縣三和農(nóng)具廠）。

1.4培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基（w/v）：干酪素3.0 g，葡萄糖4.0 g，玉米提取液0.2 g，K2HPO4 0.2 g，MgSO4?7H2O 0.01 g，pH 8.8。115 ℃下滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基（w/v）：牛肉膏0.4 g、 蛋白胨0.6 g、酵母膏0.2 g、NaCl 0.5 g，pH 8.8。121 ℃下滅菌20 min。

2方法

2.1丙酮沉淀法提取彈性蛋白酶

發(fā)酵液在4 ℃、5 000 r/min條件下離心30 min，去除菌體，上清液置冰浴中。取上清液，加入與上清液等體積的預(yù)冷丙酮，充分?jǐn)嚢韬笤?℃下靜置30 min。4 ℃，5 000 r/min離心30 min，棄上清液，即得酶蛋白粗品。收集后測(cè)定酶活性。

2.2酶的分離純化

2.2.1pH值對(duì)鹽析的影響加入65%的硫酸銨作鹽析時(shí)的沉淀劑，測(cè)量不同pH條件下沉淀出酶的活性，確定最適鹽析pH值。

2.2.2鹽析時(shí)硫酸銨最佳濃度的確定發(fā)酵液在4 ℃，5 000 r/min條件下離心30 min，去除菌體。冰浴條件下向發(fā)酵液中緩慢加入不同量的硫酸銨，鹽析液在4 ℃下靜置過夜。4 ℃，5 000 r/min離心30 min，分別收集酶蛋白和上清液。將收集的酶蛋白粗品溶于0.02 mol/L、pH 8.0的100 mL Tris-HCl緩沖液中透析，測(cè)定酶活性，并確定硫酸銨的最佳鹽析濃度。

2.2.3DEAE-Sephadex A-25陰離子交換層析鹽析、透析后的酶液采用聚乙二醇濃縮至適當(dāng)濃度后過離子交換柱。洗脫液檢測(cè)A280值，吸附的蛋白質(zhì)用NaCl溶液連續(xù)線性洗脫。NaCl濃度0~0.6 mol/L，共800 mL，流速為5 mL/min，每管收集5 mL。分別測(cè)定各管A280值和酶活性，合并具有活性的各管溶液，并檢測(cè)酶液的酶活性。

2.2.4Sephadex G-75凝膠過濾層析[2]收集經(jīng)過離子交換柱的酶液，用聚乙二醇濃縮至4 mL，加入用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液平衡過的Sephadex G-75凝膠柱中，洗脫并分部收集，流速為5 mL/min，每管收集5 mL，分別檢測(cè)各管A280值和酶活性。

2.2.5SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）按照Laemmli方法，采用DYY-Ⅲ型垂直板電泳槽進(jìn)行SDS-PAGE，電泳后的凝膠直接銀染或考馬斯亮藍(lán)染色。

3結(jié)果與討論

3.1丙酮沉淀法制取彈性蛋白酶的結(jié)果

對(duì)經(jīng)丙酮沉淀純化后的粗酶進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，在相對(duì)分子質(zhì)量32 ×103處有一條單一的蛋白質(zhì)條帶，與文獻(xiàn)報(bào)道的彈性蛋白酶相對(duì)分子質(zhì)量大小基本一致。結(jié)果見圖1。

3.2pH值對(duì)鹽析的影響

酶在等電點(diǎn)或接近等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，所以，需要調(diào)整發(fā)酵液的pH值盡量接近等電點(diǎn)。圖2是硫酸銨濃度65 ％時(shí)，不同pH條件下彈性蛋白酶酶活性的測(cè)定結(jié)果。由圖2可見，pH4.91時(shí)，沉淀所得酶的活性較高，為144.9 U/mL；pH7.1時(shí)，沉淀所得酶的活性較低，為128.8 U/mL。因此，在酶分級(jí)沉淀的第1步去除雜蛋白質(zhì)時(shí)，將發(fā)酵液pH調(diào)至7.1，第2步沉淀酶時(shí)，可將pH調(diào)至4.91。

3.3硫酸銨分段鹽析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

透析結(jié)束后測(cè)酶活性，結(jié)果見圖3。硫酸銨濃度為65 ％時(shí)酶活性較高，可達(dá)434.7 U/mL。綜合考慮酶的得率和酶活性，應(yīng)收集硫酸銨濃度30 ％~65 ％之間的沉淀。經(jīng)過硫酸銨分段鹽析，酶活性提高了3.45倍，達(dá)到434.7 U/mL。

3.4DEAE-Sephadex A-25陰離子交換層析結(jié)果

以洗脫液收集管數(shù)為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)A280值為左縱坐標(biāo)，洗脫時(shí)NaCl濃度為右縱坐標(biāo)，繪制的洗脫曲線見圖4。由圖4可見，NaC1濃度為0.125～0.400 mol/L時(shí)洗脫出多個(gè)蛋白質(zhì)峰。表明鹽析、透析后的酶液仍含有雜蛋白質(zhì)。通過洗脫已將多種蛋白質(zhì)分離開。NaC1濃度高于0.4 mol/L時(shí)，基本沒有蛋白質(zhì)洗出。洗脫液第46～63管，有酶活性存在，第55、56管酶的活性最高。NaC1濃度0.154～0.187 mol/L時(shí)，即可將彈性蛋白酶洗脫下來。

3.5Sephadex G-75凝膠過濾層析結(jié)果

合并經(jīng)過陰離子交換層析后有活性的收集管內(nèi)溶液，透析、濃縮后用凝膠過濾層析柱純化。橫坐標(biāo)為收集管數(shù)，縱坐標(biāo)為A280吸收度值，繪制洗脫曲線，結(jié)果見圖5。

由圖5可見，有2個(gè)大的和1個(gè)小的蛋白質(zhì)洗脫峰，大峰沒有酶活性，小峰有酶活性。表明經(jīng)過離子交換層析后的酶液還含有雜蛋白質(zhì)，且雜蛋白質(zhì)的量高于酶的量。在收集管26～38號(hào)出現(xiàn)彈性蛋白酶的活性峰。

4結(jié)論

綜上所述，通過鹽析，離子交換柱層析和凝膠過濾柱層析后得到較純的酶，結(jié)果見表1。最終彈性蛋白酶純化倍數(shù)為33倍，酶比活達(dá)到528 U/mg，但回收率有待提高。

參考文獻(xiàn)

[1]陳麗娟，劉宇峰，夏海華，等. 枯草桿菌產(chǎn)彈性酶及提純工藝研究[J]. 生物技術(shù)，2003，13（1）：20-21.