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本文作者：徐彩華吳晨陳亦江作者單位：南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸心外科

非小細(xì)胞肺癌組織中wt1mRNA的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，在79例非小細(xì)胞肺癌組織中，WT1mRNA的相對表達(dá)量（4.5×10－3）是相應(yīng)癌旁組織相對表達(dá)量（1.7×10－3）的2.6倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖1）。

成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pLV-GFP-WT1

構(gòu)建的重組質(zhì)粒pLV-GFP-WT1經(jīng)PCR和0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得片段大小正確（1500bp）的克隆（圖2）。挑選PCR鑒定正確的克隆進(jìn)行測序，測序結(jié)果證明與GenBank數(shù)據(jù)庫中WT1（NM_024426.4）比對正確，表明重組質(zhì)粒pLV-GFP-WT1構(gòu)建成功。

蛋白質(zhì)印跡法檢測重組質(zhì)粒pLV-GFP-WT1轉(zhuǎn)染后H1299細(xì)胞中WT1蛋白的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pLV-GFP-WT1轉(zhuǎn)染后24、36、48和60h，pLV-GFP-WT1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中WT1蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組和Lipo組（圖3），說明高表達(dá)WT1的肺癌H1299細(xì)胞構(gòu)建成功。

WT1促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞的增殖

CCK-8檢測結(jié)果顯示，WT1過表達(dá)組在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24、36和48h時的D值高于對照組（P＜0.05），對照組和Lipo組細(xì)胞在每個時間點的D值之間無明顯差異（P＞0.05）。從質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24h開始，WT1過表達(dá)組細(xì)胞的細(xì)胞增殖率開始增加（17.6%）；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后36h，WT1過表達(dá)組細(xì)胞的細(xì)胞增殖率達(dá)到最高（28.3%）；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48h，WT1過表達(dá)組細(xì)胞的細(xì)胞增殖率有所下降（21.1%）；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后60h，WT1過表達(dá)組細(xì)胞的增殖率（7.9%）進(jìn)一步下降（表1）。

本研究發(fā)現(xiàn)，WT1在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)量顯著高于相應(yīng)癌旁組織，其高表達(dá)能顯著促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖，并在非小細(xì)胞肺癌中扮演癌基因的角色。

WT1基因定位于染色體11p13q上，是一個非常重要并有多種功能的基因[11,12]。它首先作為腫瘤的抑癌基因被發(fā)現(xiàn)，也是最為人熟知的抑癌基因之一。但很多證據(jù)證明，它在某些腫瘤中作為癌基因存在[13-15]。比如：WT1在白血病、乳腺癌和惡性間皮瘤等中高表達(dá)[14,16-18]。同時，Vicent等[9]發(fā)現(xiàn)，無論是在人肺癌細(xì)胞還是小鼠肺癌細(xì)胞中，WT1的缺失降低了細(xì)胞的增殖，但對細(xì)胞凋亡的影響非常小，他們認(rèn)為WT1的缺失和WT1高表達(dá)可能帶來的是截然不同的結(jié)果。

本研究收集了79例非小細(xì)胞肺癌及其相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，并對其進(jìn)行了實時熒光定量PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WT1mRNA在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的癌旁組織（P＜0.01），說明非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生與WT1基因有著密切的關(guān)系，WT1基因高表達(dá)可能會促進(jìn)肺癌組織的生長，與肺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。這對肺癌患者的預(yù)后是不利的。

本研究將重組質(zhì)粒pLV-GFP-WT1轉(zhuǎn)染至非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞中，對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖情況進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pLV-GFP-WT1后24、36和48h的H1299細(xì)胞，其增殖率高于對照組，36h時細(xì)胞增殖率最高達(dá)28.3%，36h后細(xì)胞增殖率逐漸下降。筆者推測，這種現(xiàn)象可能是由于脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染的方法并沒有把目的基因融合到宿主基因組中，轉(zhuǎn)染剛開始WT1基因在細(xì)胞中的表達(dá)量逐漸增加，對細(xì)胞增殖的作用也相應(yīng)增加，在轉(zhuǎn)染后36h達(dá)到頂峰；但隨著細(xì)胞分裂，WT1基因在細(xì)胞內(nèi)逐漸丟失，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量下降，導(dǎo)致細(xì)胞增殖率下降。

本研究通過臨床標(biāo)本檢測和體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，WT1基因在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)水平較高，對非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞的生長起促進(jìn)作用，WT1基因在非小細(xì)胞肺癌中扮演著癌基因的角色。本研究小組后續(xù)將進(jìn)一步研究WT1基因?qū)Ψ切〖?xì)胞肺癌是否存在抗凋亡作用以及WT1基因在裸鼠體內(nèi)的成瘤情況。相信在不遠(yuǎn)的將來，也許WT1基因?qū)裆掀どL因子一樣，成為非小細(xì)胞肺癌診斷和治療的一個新靶點。