前言：本站為你精心整理了醋酸棉酚對(duì)白血病HL范文，希望能為你的創(chuàng)作提供參考價(jià)值，我們的客服老師可以幫助你提供個(gè)性化的參考范文，歡迎咨詢。

【關(guān)鍵詞】細(xì)胞凋亡

EffectsofgossypolaceticacidonapoptosisanddifferentiationinleukemiaHL60cells

【Abstract】AIM:Toinvestigatetheeffectsofgossypolaceticacid(GAA)onapoptosisanddifferentiationinclassichumanactuepromylocyticleukemiacelllineHL60andstudythepossibilitytotreatleukemiawithit.METHODS:ThecytotoxicactivityofGAAonHL60cellswasdetectedbymeansofMTTassay.Apoptosiswasidentifiedandanalyzedwiththehelpoftransmissionelectronmicroscopy,cellcycle,andDNAgelelectrophoresis,etc.ThedifferentiationofHL60cellsintomorematuregranulocyteswasdetectedbynitrobluetetrazolium(NBT)reductiontest.RESULTS:Morethan6μmol/LGAAcouldsuppresstheproliferationandinducetheapoptosisinHL60cellsinadosedependentmanner.NBTreductiontestdemonstratedthatHL60cellscouldalsobeinducedtodifferentiateintomorematuregranulocytesbylowdoseGAA(1,4μmol/L,P<0.05).CONCLUSION:GAAcouldselectivelyinducetheapoptosisofleukemiaHL60cellsinasmallerdosethanthatforhumanperipheralbloodmononuclearcells,whichsuggeststhatitmaybeanidealdrugforleukemiatherapy.

【Keywords】gossypol;HL60cells;celldivision;apoptosis;celldifferentiation

【摘要】目的：通過醋酸棉酚（GAA）對(duì)經(jīng)典白血病細(xì)胞系hl60的研究，探索GAA治療白血病的可能性.方法：用細(xì)胞培養(yǎng)、四唑鹽比色試驗(yàn)（MTT）、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、DNA電泳及NBT還原試驗(yàn)等方法觀察不同濃度GAA促進(jìn)HL60細(xì)胞凋亡及誘導(dǎo)分化的作用.結(jié)果：GAA在濃度>6μmol/L時(shí)可顯著抑制HL60細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，并表現(xiàn)出劑量效應(yīng)；在誘導(dǎo)分化濃度下（1,4μmol/L），GAA可促進(jìn)HL60細(xì)胞向成熟粒細(xì)胞分化(P<0.05).結(jié)論：GAA對(duì)白血病細(xì)胞HL60的選擇性促凋亡作用表明其可能是一種理想的高效低毒抗白血病藥物.

【關(guān)鍵詞】棉酚；HL60細(xì)胞；細(xì)胞分裂；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞分化

0引言

白血病發(fā)病率有顯著升高的趨勢(shì)［1］.近年來，多酚類藥物的抗腫瘤作用日益受到重視［2］.作為多酚類藥物的一分子，棉酚天然存在于錦葵科某些植物的根、莖、種子中，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為2,2′聯(lián)二萘8,8′二羧基醛1,1′,6,6′,7,7′六羥基5,5′二異丙基3,3′二甲基，分子質(zhì)量為518.54，具有多種生物學(xué)活性［3］.然而，以往曾經(jīng)報(bào)道棉酚的抗腫瘤作用卻未得到多數(shù)學(xué)者的認(rèn)可.近年隨著研究的深入，其顯著的抗腫瘤作用又重新得到了人們的重視［4］.棉酚對(duì)白血病細(xì)胞的作用效果如何，有無臨床使用價(jià)值？我們通過使用其衍生物醋酸棉酚（GAA）對(duì)經(jīng)典的白血病HL60細(xì)胞系進(jìn)行研究，觀察其對(duì)HL60細(xì)胞增殖、分化的影響.

1材料和方法

1.1材料人急性白血病HL60細(xì)胞系由本室保存.正常人單個(gè)核細(xì)胞（PBMNCs）來自第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院輸血科正常獻(xiàn)血員供血離心白細(xì)胞層.RPMI1640（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料研究所）.GAA、四唑氮藍(lán)（MTT）及硝基藍(lán)四氮唑（NBT）購(gòu)自Sigma公司.電子顯微鏡（日本JEOL公司）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)BioRad公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BeckmanCoulter公司）.

1.2方法

1.2.1試劑準(zhǔn)備用二甲基亞砜（DMSO）溶解GAA，濃度為12.5mmol/L，過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?RPMI1640按說明配制.FBS于56℃30min滅活，分裝，-20℃凍存?zhèn)溆?MTT用0.01mmol/LPBS配制成濃度5g/L溶液，NBT用9g/L生理鹽水配成為2g/L溶液，分別過濾除菌，避光4℃保存?zhèn)溆?

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)HL60細(xì)胞以1×108/L密度接種于含100mL/LFBS的RPMI1640培養(yǎng)基，置37℃,50mL/LCO2，飽和濕度的孵箱培養(yǎng)，每3～4d傳代1次.將正常獻(xiàn)血員分離的白細(xì)胞層用比重為1.077的淋巴細(xì)胞分離液分離，收集PBMNCs，經(jīng)RPMI1640培養(yǎng)液洗滌，調(diào)整到所需細(xì)胞濃度培養(yǎng)［5］.

1.2.3不同濃度GAA抑制HL60細(xì)胞增殖的作用GAA濃度從100μmol/L開始.以含同樣梯度濃度DMSO的PRMI1640培養(yǎng)基為平行孔.將HL60細(xì)胞以4×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100μL.培養(yǎng)24h后按倍比稀釋濃度梯度加入GAA，繼續(xù)培養(yǎng).每孔加入5g/LMTT20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，離心吸去培養(yǎng)液，每孔加入150μLDMSO震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解.用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)A490nm.以濃度為橫軸，A值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線并計(jì)算半數(shù)抑制濃度值（IC50）［6］.檢測(cè)GAA對(duì)PBMNCs的作用方法同上，接種密度為1.5×105/孔.

1.2.4超微結(jié)構(gòu)觀察將終濃度為20μmol/L的GAA作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL60細(xì)胞，24h后收獲細(xì)胞，PBS洗滌2次，轉(zhuǎn)移至Eppendorf管，1500r/min離心15min.40mL/L戊二醛固定，電子顯微鏡觀察.

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期將終濃度為20μmol/L的GAA作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL60細(xì)胞，16h后收獲細(xì)胞，PBS洗滌2次，700mL/L冷乙醇固定.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期.

1.2.6DNA梯度電泳按參考文獻(xiàn)［7］進(jìn)行，將終濃度為20μmol/L的GAA作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL60細(xì)胞，24h后收獲細(xì)胞，PBS洗滌2次，裂解緩沖液混勻，加入蛋白酶K56℃消化過夜，酚氯仿抽提，冷乙醇沉淀，TE溶解.18g/L瓊脂糖凝膠50V電壓電泳1h，觀察DNAladder.

1.2.7形態(tài)學(xué)觀察根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用1μmol/L與4μmol/L作為GAA誘導(dǎo)分化用濃度.在含100mL/LFBS的RPMI1640,4×107/L的HL60細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入不同濃度的GAA培養(yǎng)5d，將細(xì)胞離心涂片，WrightGiemsa染色，油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài).

1.2.8NBT還原試驗(yàn)將用終濃度1μmol/L與4μmol/L的GAA處理的HL60細(xì)胞培養(yǎng)1~5d.收集細(xì)胞，以不含血清的RPMI1460洗滌離心，棄上清，每管加2g/LNBT0.5mL和0.1mL佛波酯（TPA）200mg/L溶液，搖勻，37℃反應(yīng)30~60min.吸取少量細(xì)胞懸液，涂片，空氣干燥，常規(guī)WrightGiemsa染色.以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)藍(lán)紫色斑者為陽(yáng)性.隨機(jī)在光學(xué)顯微鏡下觀察200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性百分率.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，各組間差異采用方差分析.半數(shù)抑制濃度（IC50）的計(jì)算采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包的Probit回歸分析完成.

2結(jié)果

2.1GAA對(duì)人白血病HL60細(xì)胞系增殖的影響隨著GAA濃度的升高，GA對(duì)HL60細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的抑制增殖作用.說明GAA對(duì)HL60細(xì)胞有著明顯的濃度依賴效應(yīng)（圖1）.

圖1不同濃度的GAA對(duì)HL60細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（略）

2.2GAA對(duì)PBMNCs增殖的影響當(dāng)GAA>12μmol/L時(shí)，GAA才對(duì)PBMNCs表現(xiàn)出明顯的殺傷效應(yīng).提示GAA對(duì)正常PBMNCs的作用濃度要顯著高于對(duì)白血病細(xì)胞作用濃度，提示GAA對(duì)白血病細(xì)胞存在明確的選擇殺傷作用（圖2）.

圖2不同濃度的GAA對(duì)PBMNCs細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（略）

2.3電子顯微鏡超微結(jié)構(gòu)觀察大量的細(xì)胞表現(xiàn)出染色質(zhì)邊集等凋亡現(xiàn)象（圖3）.

圖3大量的20μmol/L終濃度GAA處理24h后的HL60細(xì)胞表現(xiàn)出染色質(zhì)邊集等凋亡現(xiàn)象TEM×7500（略）

2.4流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果提示出現(xiàn)明顯的亞G1凋亡峰（圖4）.

圖420μmol/L終濃度GAA處理16h后HL60細(xì)胞，有明顯的亞G1凋亡峰（略）

2.5梯度DNA電泳可見明顯的DNAladder形成，提示GAA可以促進(jìn)HL60細(xì)胞凋亡（圖5）.

2.6GAA對(duì)HL60細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明：陰性對(duì)照組HL60細(xì)胞體積大，外形不規(guī)則；核大，染色質(zhì)疏松細(xì)致，可見多個(gè)核仁，核質(zhì)比例大.經(jīng)GAA處理的HL60細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生明顯變化，細(xì)胞體積變小，核染色質(zhì)濃縮，核質(zhì)比例變小，胞質(zhì)呈灰藍(lán)色，原始細(xì)胞減少.NBT還原試驗(yàn)結(jié)果顯示，1μmol/L與4μmol/LGAA處理的HL60細(xì)胞NBT還原試驗(yàn)陽(yáng)性率呈時(shí)間依賴性增高，并與劑量有關(guān)(P<0.05).1μmol/L與4μmol/L濃度GAA處理5d的HL60細(xì)胞NBT還原試驗(yàn)陽(yáng)性率分別為34%和45%(P<0.05，表1）.

2.7IC50經(jīng)計(jì)算，GAA對(duì)HL60細(xì)胞的IC50值為9.4μmol/L，而對(duì)PBMNCs的IC50值為48.0μmol/L.

1:100bpmarker;2:20μmol/L濃度GAA作用16h后可見少量的ladder;3:20μmol/L濃度GAA作用24h后可見明確的ladder.

圖5GAA作用后HL60細(xì)胞DNA電泳圖（略）

表1低濃度GAA對(duì)HL60細(xì)胞誘導(dǎo)分化后NBT還原試驗(yàn)陽(yáng)性率（%）變化（略）

aP<0.05vs空白對(duì)照,cP<0.05vs1μmol/LGAA.

3討論

目前臨床用于白血病的化療藥物包括烷化劑、抗代謝藥、抗生素及激素等.這些藥物不僅毒副作用較強(qiáng)，對(duì)骨髓抑制作用明顯，而且在長(zhǎng)期使用后會(huì)逐漸產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療失敗.作為天然藥物的棉酚具有顯著的抗實(shí)體瘤作用，且副作用較小.體外研究提示該藥物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系有著明顯的抗增殖和抗轉(zhuǎn)移作用，如乳腺癌、直腸癌、肝癌、黑素瘤等.在24h以上的細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于黑素瘤，棉酚的活性要大于順鉑、馬法蘭、達(dá)卡巴嗪等.還有人將該藥物用于治療進(jìn)展期的膠質(zhì)瘤和難治性腎上腺癌、乳腺癌等患者，均取得了令人滿意的效果，但均缺乏進(jìn)一步的深入研究［4］.棉酚口服后部分被小腸吸收，大部分經(jīng)膽汁分泌，主要代謝場(chǎng)所是肝臟.其生物半衰期為48h，各組織活性依次為胃腸道、肝臟、心臟、腎臟、血液、肌肉等.因此，口服棉酚后能維持較長(zhǎng)時(shí)間的有效血藥濃度［8］.提示棉酚比多數(shù)經(jīng)典的化療藥物有著更顯著的抗腫瘤活性，很有希望應(yīng)用于臨床治療白血病.我們的結(jié)果表明，GAA在＞6μmol/L的濃度范圍對(duì)HL60細(xì)胞有著顯著的抑制增殖、促進(jìn)凋亡作用，且與作用劑量有關(guān)，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴效應(yīng).發(fā)現(xiàn)對(duì)于正常PBMNCS,GAA的有效抑制濃度要明顯高于對(duì)HL60細(xì)胞的抑制濃度，說明GAA對(duì)白血病細(xì)胞有選擇性殺傷作用.

惡性腫瘤的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞增殖和分化之間的平衡失調(diào)有關(guān)，表現(xiàn)為增殖失控而分化受阻.許多藥物如維甲酸及某些天然成分可以促進(jìn)白血病細(xì)胞向成熟分化，這也是目前治療白血病的措施之一［9］.可見，許多天然藥通過誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化來發(fā)揮抗白血病作用.在分化誘導(dǎo)劑作用下，HL60細(xì)胞可向成熟粒細(xì)胞分化，表現(xiàn)為NBT還原試驗(yàn)陽(yáng)性［10］.我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)體系中，1μmol/L與4μmol/L的GAA均能使HL60細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，NBT還原試驗(yàn)陽(yáng)性率也明顯增高，呈時(shí)間與劑量依賴關(guān)系.這表明在誘導(dǎo)分化劑量下，GAA可促使HL60細(xì)胞向成熟粒系分化.通過誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向成熟粒細(xì)胞分化，從而抑制其增殖，這可能也是GAA抗白血病作用的機(jī)制之一.

與傳統(tǒng)的化療藥物相比，棉酚的副作用就顯得簡(jiǎn)單易于處理.過去在用于節(jié)育目的長(zhǎng)期服用時(shí)發(fā)現(xiàn)主要表現(xiàn)為低鉀血癥、個(gè)別患者睪丸生精上皮的嚴(yán)重?fù)p傷等，但發(fā)生率僅為1%左右，且臨床處理也較容易，而且相對(duì)于致命的白血病來說，這些副作用顯得微不足道.而且長(zhǎng)期口服治療劑量的棉酚不會(huì)引起骨髓抑制，這相對(duì)其他治療白血病的化療藥物而言具有無法比擬的優(yōu)勢(shì)［11-12］.更為重要的是，其代謝產(chǎn)物氧化棉酚同樣具有顯著的抗腫瘤作用，甚至比其原體活性還高.以上特點(diǎn)表明，棉酚是一種非常有前途的新型抗腫瘤藥物［13-14］.

我們的研究結(jié)果表明，GAA對(duì)白血病細(xì)胞具有選擇性殺傷及誘導(dǎo)分化作用，提示其可能成為一種新型、高效低毒的抗白血病藥物.

【參考文獻(xiàn)】

［1］FanciR,CasiniC,LeoniF,etal.RelatedArticles,Incidenceandmanagementofprovenandprobablefungalinfectionsinpatientswithacuteleukemia:Asinglecenterexperience［J］.JChemother,2004,16(6):557-560.

［2］QuineyC,DauzonneD,KernC,etal.FlavonesandpolyphenolsinhibittheNOpathwayduringapoptosisofleukemiaBcells［J］.LeukemiaRes，2004,28(8):851-861.

［3］BaderP,NiemeyerC,WillaschA.Childrenwithmyelodysplasticsyndrome(MDS)andincreasingmixedchimaerismafterallogeneicstemcelltransplantationhaveapooroutcomewhichcanbeimprovedbypreemptiveimmunotherapy［J］.BrJHaematol,2005,128(5):649-658.

［4］BushunowP,ReidenbergMM,WasenkoJ,etal.Gossypoltreatmentofrecurrentadultmalignantgliomas［J］.JNeurooncol，1999,43(1):79-86.

［5］楊丹蕾，徐永健，張珍祥，等.香煙煙霧提取物對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞IL8mRNA表達(dá)的影響［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2003,23(7):557-559.

［6］司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)［M］.西安：世界圖書出版公司.1996:186.

［7］ChenXQ,WanYF,BaiQX,etal.SodiumSalicylateTriggeredApoptosisinHL60CellsDependsonCaspase8Activation［J］.InterJHematol,2002,75（4）:407-411.

［8］WaitesGM,WangC,GriffinPO.Gossypol:Reasonforitsfailuretobeacceptedasasafe,reversiblemaleantifertilitydrug［J］.IntJAndrol,1998,21(1):8-12.

［9］VeselskaR,ZitterbartK,AuerJ,etal.DifferentiationofHL60myeloidleukemiacellsinducedbyalltransretinoicacidisenhancedincombinationwithcaffeicacid［J］.IntJMolMed,2004,14(2):305-310.

［10］張永清，黃高，陳協(xié)群，等.HL60細(xì)胞定向分化時(shí)Bcl6的表達(dá)［J］.中華血液學(xué)雜志，2004,25（9）:569-571.

［11］ShelleyMD,HartleyL,FishRG,etal.Stereospecificcytotoxiceffectsofgossypolenantiomersandgossypoloneintumourcelllines［J］.CancerLetters,1999,135(2):171-180.

［12］OliverCL,MirandaMB,ShangaryS,etal.GossypolactsdirectlyonthemitochondriatoovercomeBcl2andBclX(L)mediatedapoptosisresistance［J］.MolCancerTher,2005,4(1):23-31.

［13］CoutinhoEM,AthaydeC,AttaG.Gossypolbloodlevelsandinhibitionofspermatogenesisinmentakinggossypolasacontraceptive.Amulticenter,international,dosefindingstudy［J］.Contraception,2000,61:61-67.

［14］YuZH,ChanHC.Gossypolasamaleantifertilityagentwhystudiesshouldhavebeencontinued［J］.IntJAndrol,1998,21(1):2-7