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【摘要】目的分離和篩選具有抗細(xì)菌和抗真菌活性的紅樹(shù)林內(nèi)生真菌。方法從紅樹(shù)林植物桐花樹(shù)、海漆、秋茄、木欖、白骨壤、銀葉樹(shù)中分離到60株內(nèi)生真菌，對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行抗菌檢測(cè)，通過(guò)濾紙片法來(lái)檢測(cè)內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抗細(xì)菌和抗真菌活性。結(jié)果共有35株內(nèi)生真菌具有抗細(xì)菌活性，占待側(cè)菌株總數(shù)的58.3％，其中以不產(chǎn)孢類(lèi)、青霉屬、曲霉屬、鐮孢屬為主，分別占活性菌株總數(shù)的51.4％、8.6％、8.6％、8.6％；共有49株內(nèi)生真菌具有抗真菌活性，占待側(cè)菌株總數(shù)的81.7％，其中以不產(chǎn)孢類(lèi)和盤(pán)長(zhǎng)孢屬為主，分別占活性菌株總數(shù)的44.9％、17.1％。結(jié)論紅樹(shù)林內(nèi)生真菌是抗菌活性物質(zhì)的一個(gè)潛在的、豐富的資源庫(kù)，值得進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)。

【關(guān)鍵詞】紅樹(shù)林；內(nèi)生真菌；代謝產(chǎn)物；生物活性

Abstract:ObjectiveToisolateandscreenfungalendophyteswithantibacterialandantifungalactivitiesfrommangroveplants.MethodsTheantibacterialandantifungalactivitiestestoffungalendophytesfrommangroveplantswereusedbypaperdiscmethod.ResultsSixtystrainsofendophyticfungiwereisolatedfromAegicerascorniculatum,Excoecariaagallocha,Kandeliacandel,Bruguieragymnorrhiza,Avicenniamariana,Heritieralittoralis.Theresultoftheantibacterialandantifungalassayshowsthatthirtyfivestrainsoftheendofungi(58.3%oftotaltestedstrains)haveantibacterialactivities,theactivestrainsmostlybelongtosterilegroups(51.4%ofactivestrains),Penicillium(8.6%),Aspergillus(8.6%),Fusarium(8.6%);fortyninestrains(81.7%oftotaltestedstrains)haveantifungalactivites,mostofthembelongtosterilegroups(44.9%ofactivestrains),andGloeosporium(17.1%).ConclusionMangrovefungalendophyteswerepotentialandrichresourcesofantimicrobialcompounds,whichneedtoexplorefurther.

Keywords:mangroveplants,fungalendophytes,metabolites，bioactivity

內(nèi)生真菌(endophyte)指生活于健康植物組織內(nèi)部、不引發(fā)植物產(chǎn)生明顯病癥的一類(lèi)真菌。但在植物衰老或外界刺激條件下，植物自身免疫力下降，也可能出現(xiàn)某些病癥。它們?nèi)炕虿糠稚钪芷谏钤谥参锝M織內(nèi)。這類(lèi)真菌生活在植物體這一特殊生境中，不但能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育［1］，提高宿主植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的抵抗能力［2］，還能產(chǎn)生多種具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，在醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)的生物防治方面都顯示出重要的應(yīng)用價(jià)值［3］。

1993年,Strobel等［4］等從短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia)的韌皮部中分離到一株能產(chǎn)紫杉醇（Taxol)的內(nèi)生真菌（Taxomycesandreanae)，受此啟發(fā),國(guó)內(nèi)外學(xué)者也相繼在其他陸生植物開(kāi)展此方面的研究，并從中分離具有多種具有抗腫瘤活性、抗真菌活性、免疫抑制活性的內(nèi)生真菌［5,6］。紅樹(shù)林作為生長(zhǎng)在熱帶和亞熱帶海灣河口潮間帶的一種特殊的生態(tài)系統(tǒng)，一直處于高鹽、頻繁的潮汐、強(qiáng)風(fēng)、高溫、強(qiáng)紫外輻射和缺氧污泥的海陸潮間帶環(huán)境［7］，其生境非常特殊，研究發(fā)現(xiàn)它們自身許多成分也具有抗菌、抗病毒和抗腫瘤等藥用價(jià)值［8］。它們的內(nèi)生真菌同時(shí)又具有海洋微生物的特點(diǎn)，這也使得紅樹(shù)林內(nèi)生真菌具有獨(dú)特的代謝途徑和遺傳背景，其種類(lèi)和產(chǎn)物化學(xué)類(lèi)型多樣性也比較豐富，因此有可能從中發(fā)現(xiàn)一些新的真菌種類(lèi)和新的代謝產(chǎn)物。本研究對(duì)深圳福田紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)的6種紅樹(shù)林的內(nèi)生真菌進(jìn)行了較為系統(tǒng)的分離，并從中篩選具有抗菌活性的菌株，為開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1植物樣品來(lái)源

在深圳福田紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)采集桐花樹(shù)（Aegicerascorniculatum）、海漆（Excoecariaagallocha）、秋茄（Kandeliacandel）、木欖（Bruguieragymnorrhiza）、白骨壤（Avicenniamariana）、銀葉樹(shù)（Heritieralittoralis）的葉、莖、根、樹(shù)皮、氣生根等樣品，采集后放于冰盒中保存,4h內(nèi)處理樣品，進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1PDA培養(yǎng)基

馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂15g,50％人工海水1000mL。

1.2.2真菌發(fā)酵培養(yǎng)基

2％葡萄糖，1％蛋白胨，0.5％酵母膏，50％的人工海水，pH6.5。

1.2.3LB培養(yǎng)基

稱(chēng)取10g蛋白胨、5g酵母膏、10gNaCl，加蒸餾水溶解后，調(diào)pH至7.4，定容至1000mL。

1.2.4促孢培養(yǎng)基

KH2PO41g,KNO31g,MgSO4·7H2O0.5g,KCl0.5g,淀粉0.2g,葡萄糖0.2g,蔗糖0.2g,瓊脂15g,水1000mL。

1.3拮抗試驗(yàn)菌株

1.3.1試驗(yàn)細(xì)菌

金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusNICPBP26112)，枯草芽孢桿菌(BacillussubtilusMIG1.22)、大腸桿菌(EscherichiacoliATCC8739)、青枯菌（Ralstoniadolaanacearum）分離于番茄植株。

1.3.2試驗(yàn)真菌

假絲酵母菌(CandidaalbicansATCC10231)，釀酒酵母(SaccharomycescerevisiaeMIG2.34)均購(gòu)自廣東省微生物研究所。新月彎孢霉(Curvularialunata)由本實(shí)驗(yàn)室保存；茄絲核菌（RhizoctoniasolaniK）分離于患病番茄植株；葉枝霉(Cladosporiumherbarum)分離于患病番茄植株；尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)分離于香蕉植株。

1.4植物內(nèi)生真菌的分離

葉、葉脈、莖、樹(shù)皮（韌皮部）等樣品用自來(lái)水沖洗掉泥土，然后進(jìn)行嚴(yán)格的表面消毒程序：依次浸泡在75％酒精1min，3%～5%有效氯的次氯酸鈉溶液3min，75%的酒精0.5min，然后再用無(wú)菌水沖洗3遍。晾干后，在超靜臺(tái)將其剪成約0.5cm×0.5cm左右小片。將處理好后剪成的小片鋪于PDA平板上，加入氯霉素與鏈霉素各50μg/mL抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，在26℃培養(yǎng)培養(yǎng)2～3周分離內(nèi)生真菌。這些平板在第1周要每天檢查1次，然后可以3、4d檢查1次。一旦發(fā)現(xiàn)有菌絲從組織小塊長(zhǎng)出，應(yīng)馬上將其轉(zhuǎn)接到另一新的平板上，經(jīng)幾次純化保存于PDA斜面。

1.5表面消毒效果檢查

參考文獻(xiàn)［9］方法觀(guān)察表面消毒效果。

1.6內(nèi)生真菌的鑒定

使用PDA培養(yǎng)基,采用載玻片法培養(yǎng)內(nèi)生真菌,根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》［10］中描述的真菌形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。不產(chǎn)孢子的菌株，需使用催孢培養(yǎng)基或紫外線(xiàn)照射來(lái)誘導(dǎo)孢子的產(chǎn)生。仍不產(chǎn)孢者歸不產(chǎn)孢類(lèi)。

1.7內(nèi)生真菌發(fā)酵及代謝物提取

分離到的紅樹(shù)林內(nèi)生真菌斜面培養(yǎng)物經(jīng)活化后分別接種至20mL真菌發(fā)酵培養(yǎng)基，26℃搖床上以190r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)7～10d，發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵物冷凍干燥，再用10mL甲醇浸泡抽提1d。取甲醇提取液清液，揮發(fā)干后，用2mL甲醇溶解配成10倍濃縮液。

1.8內(nèi)生真菌代謝物抗細(xì)菌、抗真菌活性檢測(cè)

采用濾紙片法進(jìn)行抗菌活性檢測(cè):活化后的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌與青枯菌培養(yǎng)液用無(wú)菌水稀釋至10-4，取0.1mL菌懸液（約105cfu/mL）涂布于LB平板上。用濾紙片（直徑5mm）吸取內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物粗提物溶液，放置于平板上，37℃培養(yǎng)1～2d，觀(guān)察抑菌圈的大小及有無(wú)。白色念球菌除取10-3稀釋液200μL涂布PDA平板外，其余均與細(xì)菌相同，并用空白濾紙片吸取甲醇溶液作為空白對(duì)照；將絲狀病原真菌接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，在病原菌周?chē)胖糜么痔嵛锝^(guò)的濾紙片，培養(yǎng)3～5d后觀(guān)察病原菌菌落生長(zhǎng)情況，并用空白濾紙片吸取甲醇溶液作為空白對(duì)照。

2結(jié)果

2.1紅樹(shù)林內(nèi)生真菌的分離

本研究從深圳福田紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)的6種紅樹(shù)林多個(gè)部位共分離到60株內(nèi)生真菌作為抗細(xì)菌活性和抗真菌活性的待篩菌株，并對(duì)它們進(jìn)行了分類(lèi)鑒定，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，分離到60株紅樹(shù)林內(nèi)生真菌包括11個(gè)屬和不產(chǎn)孢類(lèi)，其中以不產(chǎn)孢類(lèi)、盤(pán)長(zhǎng)孢屬、鐮孢屬、曲霉屬為主要類(lèi)群，分別占45.0％、11.7％、8.3％、8.3％。

表160株待篩菌株種類(lèi)及來(lái)源（略）

Tab.1Thetaxaandoriginof60endophyticfungiwhicharescreened

2.2紅樹(shù)林內(nèi)生真菌的抗細(xì)菌活性

從表2可以看出，在60株待篩紅樹(shù)林內(nèi)生真菌中，有35株內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物對(duì)一種或多種指示細(xì)菌有抑制活性，占待篩菌株的58.3％，這說(shuō)明紅樹(shù)林內(nèi)生真菌存在著豐富的抗細(xì)菌資源。

2.3紅樹(shù)林內(nèi)生真菌的抗真菌活性

紅樹(shù)林內(nèi)生真菌對(duì)細(xì)菌的拮抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以發(fā)現(xiàn)，60株待篩紅樹(shù)林內(nèi)生真菌甲醇代謝產(chǎn)物有49株（占81.7%）的代謝產(chǎn)物具有抗真菌活性；其中有42株內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物對(duì)絲狀真菌具有抗性，占待側(cè)菌總數(shù)的70.0％；有22株紅樹(shù)林內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物對(duì)人類(lèi)皮膚深部感染病菌－假絲酵母菌有抗性，占待側(cè)菌總數(shù)的36.7％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅樹(shù)林內(nèi)生真菌蘊(yùn)藏著豐富的抗真菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌，是開(kāi)發(fā)抗真菌藥物的潛在資源。

2.4內(nèi)生真菌抗菌活性菌株屬的分布

從表3可以看出：紅樹(shù)林內(nèi)生真菌中具抗細(xì)菌活性的菌株分布在9個(gè)屬中，其中以不產(chǎn)孢類(lèi)、青霉屬、曲霉屬、鐮孢屬為主，各占活性菌株總數(shù)的51.4％、8.6％、8.6％、8.6％；紅樹(shù)林內(nèi)生真菌具抗真菌活性的菌株分布在12個(gè)屬中，以不產(chǎn)孢類(lèi)（44.9％）和盤(pán)長(zhǎng)孢屬（17.1％）為主。以上結(jié)果表明，內(nèi)生真菌抗菌活性菌株的種屬分布具有多樣性。

3討論

過(guò)去篩選產(chǎn)生抗菌物質(zhì)微生物的重點(diǎn)一直是土壤微生物，特別是鏈霉菌。但自20世紀(jì)60年代以來(lái)，從鏈霉菌中被重復(fù)發(fā)現(xiàn)的抗生素高達(dá)95%，篩選得到的有價(jià)值的抗生素比率逐年下降。于是人們將篩選抗菌物質(zhì)的注意力逐漸集中于其他生態(tài)系統(tǒng)的生物，尤其是那些特殊生境的微生物如海洋微生物、植物內(nèi)生菌等。近年來(lái)的研究表明,海洋微生物是新物質(zhì)的巨大寶庫(kù)，人們?cè)诤Ｑ笾姓业搅舜罅拷Y(jié)構(gòu)新穎，且活性很強(qiáng)的生物活性物質(zhì)，如抗菌、抗病毒、抗腫瘤等物質(zhì)［11］；植物內(nèi)生菌作為一種特殊生境的微生物也同樣具有豐富的生物功能多樣性，在生物控制、無(wú)公害農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥開(kāi)發(fā)方面有著很好的開(kāi)發(fā)前景。紅樹(shù)林作為生長(zhǎng)在熱帶和亞熱帶海灣河口潮間帶的特殊生態(tài)系統(tǒng)，其生境非常特殊，其體內(nèi)的內(nèi)生真菌既是植物內(nèi)生菌，又具有海洋微生物的特點(diǎn)，這也造就了紅樹(shù)林內(nèi)生真菌具有獨(dú)特的代謝途徑和遺傳背景，因此對(duì)它們的代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究可能會(huì)有可喜的發(fā)現(xiàn)。本研究結(jié)果表明，紅樹(shù)林內(nèi)生真菌具有廣泛的抗菌活性：抗細(xì)菌活性菌株占58.3％；抗真菌活性菌株占81.7％，其中70%菌株的代謝產(chǎn)物對(duì)絲狀真菌具有抗性，36.7％對(duì)人類(lèi)皮膚深部感染病菌－假絲酵母菌有抗性。內(nèi)生真菌的屬種分布和拮抗作用具有多樣性：分離到60株紅樹(shù)林內(nèi)生真菌除不產(chǎn)孢類(lèi)外，分布于11個(gè)屬，其中不產(chǎn)孢類(lèi)、盤(pán)長(zhǎng)孢屬、鐮孢屬、曲霉屬為主要類(lèi)群；紅樹(shù)林內(nèi)生真菌中不產(chǎn)孢類(lèi)抗微生物活性所占比例明顯較高，不同屬種的菌株對(duì)同一指示菌的抗菌作用有較大差別,對(duì)金黃色葡萄球菌和茄絲核菌有拮抗作用的菌株種類(lèi)較多，同屬的內(nèi)生真菌對(duì)的病原菌拮抗作用及抗菌效果也各不相同。植物內(nèi)生真菌及其抗微生物活性的多樣性為人們開(kāi)發(fā)抗菌藥物提供了重要的資源保證。

在對(duì)紅樹(shù)林內(nèi)生真菌的抗真菌活性研究發(fā)現(xiàn)，其抗真菌活性菌株比例比從水稻、香蕉等分離到的內(nèi)生真菌和其他陸生植物內(nèi)生真菌（特別是抗絲狀真菌）都要高［12-14］。這說(shuō)明紅樹(shù)林內(nèi)生真菌可能比其他環(huán)境中的真菌蘊(yùn)含著更為豐富的抗真菌活性的資源。由于真菌感染是人類(lèi)面臨的一個(gè)越來(lái)越嚴(yán)重的一個(gè)健康問(wèn)題，特別是對(duì)于艾滋病人和其他免疫力低下的患者，開(kāi)發(fā)出新的抗真菌感染的藥物顯得尤為重要。植物真菌致病菌如茄絲核菌、尖孢鐮刀菌、新月彎孢霉等都能引起多種植物的病害，而且目前沒(méi)有有效又環(huán)保方法防治，而植物內(nèi)生真菌作為生物農(nóng)藥的生物防治方法為此提供了一個(gè)新途徑。本研究結(jié)果表明，許多紅樹(shù)林內(nèi)生真菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物不僅對(duì)植物絲狀病原真菌表現(xiàn)出有著抗性而且對(duì)人類(lèi)致病真菌也存在抗性，它們?yōu)殚_(kāi)發(fā)新的抗真菌感染的藥物以及植物真菌病的生物防治提供了重要的資源庫(kù)，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步深入的研究。

表2紅樹(shù)林內(nèi)生真菌代謝物的抗細(xì)菌活性和抗真菌活性（略）

Tab.2Antibacterialandantifungiactivitiesofendophyticfungifrommangroveplants

根據(jù)抑菌圈直徑比較活性,0：無(wú)抑制活性；+：≤10mm；++：10～20mm；+++：≥20mm

表3紅樹(shù)林內(nèi)生真菌抗菌活性菌株屬的分布（略）

Tab.3Proportionoftaxaofmangroveendophyticfungiofantimicrobialactivities

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