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摘要:氣腫疽梭菌是一種具有組織毒性、有鞭毛的孢子化革蘭氏陽(yáng)性菌，可引氣腫疽這種反芻動(dòng)物高致死性急性疾病。常見(jiàn)的典型臨床癥狀為發(fā)病動(dòng)物肌肉豐滿部位發(fā)炎、腫脹，觸壓可聽(tīng)到類似捻發(fā)音，流行呈現(xiàn)一定的季節(jié)性，并有區(qū)域性流行的特征。牛氣腫疽在養(yǎng)殖場(chǎng)中一旦傳播流行，往往會(huì)伴隨巨大的經(jīng)濟(jì)損失，所以更加需要加強(qiáng)對(duì)該病的防控與診斷。本文整理了氣腫疽梭菌的3種免疫學(xué)檢測(cè)方法（間接ELISA、Dot-ELISA、免疫膠體金技術(shù)），以供參考。

關(guān)鍵詞:氣腫疽梭菌；免疫學(xué)；檢測(cè)方法

民間俗稱的黑腿病即氣腫疽的別名之一，該病由氣腫疽梭菌引起，常見(jiàn)的典型臨床癥狀為發(fā)病動(dòng)物肌肉豐滿部位發(fā)炎、腫脹，觸壓可聽(tīng)到類似捻發(fā)音[1]。發(fā)病急促，潛伏期短，病情發(fā)展迅速，許多動(dòng)物無(wú)可見(jiàn)癥狀即死亡[2]。該病主要通過(guò)患病的牛進(jìn)行傳播，其具體經(jīng)過(guò)是患病牛在草場(chǎng)采食放牧期間污染土壤或經(jīng)過(guò)集約化養(yǎng)殖的飼料與飲水進(jìn)行傳播。健康的牛采食被污染的食物后，病菌可以進(jìn)入消化道，繼而發(fā)生感染。另外，氣腫疽梭菌的芽孢能在土壤中存活相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間，成為持久的傳染源[3]。本病一年四季均有可能發(fā)生，在氣溫高且濕度低的夏季更為多見(jiàn)，在地方性流行方面也呈現(xiàn)一定的特點(diǎn)，如在地勢(shì)相對(duì)低洼的地區(qū)該病更易發(fā)生。作為梭狀芽胞桿菌屬的一員，氣腫疽屬于專性厭氧菌。其菌體的長(zhǎng)度為1.5~8.5μm，菌體兩端圓滑，無(wú)莢膜，因其有周身鞭毛而能夠運(yùn)動(dòng)，芽胞通常位于菌體中央，也有可能偏向其中一端[4]。一般來(lái)說(shuō)，37℃即接近動(dòng)物的體溫，對(duì)于氣腫疽梭菌而言是最適宜生長(zhǎng)的溫度。在血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可見(jiàn)菌落呈現(xiàn)圓形、顏色一般為半透明，中心略微隆起，邊緣不整齊，有β溶血環(huán)，但一般情況下現(xiàn)象不明顯[5]。在對(duì)該病進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，較為常用的手段多是以其流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床癥狀表現(xiàn)及呈現(xiàn)的病理特征來(lái)做出判斷。被感染的動(dòng)物通常發(fā)病迅速，甚至有的病例無(wú)可見(jiàn)癥狀即死亡。臨床上患病動(dòng)物體溫升高，可達(dá)42℃[6]。有伴發(fā)敗血癥的機(jī)率，呈現(xiàn)全身癥狀，肌肉豐厚的部位腫脹、發(fā)炎。若病變部位位于肩部或后肢，則常出現(xiàn)行動(dòng)障礙?；疾?dòng)物通常會(huì)在1~3d內(nèi)死亡，尸體腐敗速度快，天然孔可見(jiàn)暗紅發(fā)黑血液流出，通常呈現(xiàn)為泡沫樣[7]。取肌肉做切面，也呈黑紅色。該病主要危害牛羊等反芻動(dòng)物[8]，但近幾年也有人被感染的病例，這使得該病又一次成為各國(guó)各地相關(guān)人員關(guān)心的研究熱點(diǎn)。在對(duì)該病進(jìn)行診斷時(shí)，需注意該病與炭疽和惡性水腫的臨床癥狀均有一定的相似之處，應(yīng)鑒別診斷。

1間接ELISA

ELISA即酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定，是指將可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上，進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量的檢測(cè)方法。該方法自建立以來(lái)，就以其操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)迅速、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。間接ELISA原理為利用酶標(biāo)記的抗體以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體[9]。該方法是對(duì)多成分進(jìn)行分析，尤其需要注意對(duì)其組成成分進(jìn)行嚴(yán)格控制，否則將會(huì)對(duì)結(jié)果造成相當(dāng)大的影響。車達(dá)等[10]于2011年首次成功構(gòu)建了氣腫疽間接ELISA檢測(cè)方法，通過(guò)超聲波對(duì)菌體進(jìn)行破碎，將裂解后的氣腫疽梭菌菌體作為抗原，設(shè)立梯度稀釋度，并最終確定在質(zhì)量濃度為50μg/mL、酶標(biāo)二抗稀釋度為1∶2000的條件下效果最佳，成功建立了病原菌的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。該方法簡(jiǎn)便快捷，不但針對(duì)性強(qiáng)，而且在重復(fù)試驗(yàn)中也有較好的表現(xiàn)。

2Dot-ELISA

斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是一種用纖維素膜代替酶固體載體法的反應(yīng)板的免疫分析方法，該方法彌補(bǔ)了涂層薄弱、易失效、樣品少、節(jié)省材料等缺點(diǎn)[11]，原理和ELISA很相似。抗原吸附在纖維素膜上，與抗原-抗體酶標(biāo)反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物，同時(shí)保持其免疫活性。該配合物能夠在酶的參與下顯示染色結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果可以通過(guò)染色的色深來(lái)判斷。姜永越[12]成功從氣腫疽梭菌C54-1標(biāo)準(zhǔn)株中提取有效抗原，純化后用特異性最強(qiáng)的抗原免疫豚鼠。免疫4次后，血清稀釋1000倍，用ELISA檢測(cè)其OD150nm值達(dá)1.6以上。Dot-ELISA的重復(fù)性試驗(yàn)表明，血清具有特異性和穩(wěn)定性，可作為氣腫疽梭菌的雙抗體夾心Dot-ELISA檢測(cè)方法。當(dāng)以1∶1024稀釋抗體時(shí)，抗原最小含量為3.15μg，分泌抗原最小含量為1.89μg，酶標(biāo)二抗的最佳濃度為1∶4000，可以檢測(cè)到微量氣腫疽梭菌毒素。

3免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，應(yīng)用于抗原抗體的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)[13]。該技術(shù)具有制備簡(jiǎn)便、標(biāo)記簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、敏感性高、定位準(zhǔn)確、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，且膠體金試紙保存方便，無(wú)需任何復(fù)雜的儀器設(shè)備，可憑肉眼判斷結(jié)果。該技術(shù)的進(jìn)步能夠極大地方便各種疾病在現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)，因此在近些年得到了飛速的發(fā)展。任春宇等[14]參考了免疫層析法的技術(shù)，選取氣腫疽梭菌標(biāo)準(zhǔn)株，制備氣腫疽梭菌單克隆抗體，并根據(jù)抗原-抗體的特性將單克隆抗體與膠體金標(biāo)記結(jié)合，建立了不需要再加入任何檢測(cè)試劑且快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，成功研制出了膠體金免疫層析試紙條，可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)氣腫疽做出準(zhǔn)確診斷。該方法與ELISA檢測(cè)相比，反應(yīng)更為快捷，也呈現(xiàn)出了更強(qiáng)的特異性，當(dāng)抗原量≥1×105CFU/mL時(shí)，即可檢測(cè)成功，且有較好的穩(wěn)定性。

4小結(jié)

自20世紀(jì)以來(lái)，氣腫疽在國(guó)內(nèi)20多個(gè)地區(qū)的暴發(fā)給我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[15]。對(duì)于氣腫疽這種病程短、發(fā)病急、危害嚴(yán)重的傳染性疾病而言，及時(shí)鑒別和快速診斷是極為重要的控制手段。因此，需要加強(qiáng)對(duì)該病的研究，采用分子生物學(xué)和免疫學(xué)的手段，一方面加快對(duì)新型疫苗的研制，另一方面要建立更加簡(jiǎn)便有效的檢測(cè)方法。只有這樣才能更好地控制氣腫疽的傳播和蔓延，將該病帶來(lái)的損失降到最小。以上列出的3種免疫學(xué)檢測(cè)方法各有優(yōu)勢(shì)與局限性，需要針對(duì)實(shí)際需求、臨床操作條件以及試驗(yàn)環(huán)境[16]選擇符合條件的病原體檢測(cè)方法進(jìn)行疾病診斷。另外，也有相當(dāng)多的分子生物學(xué)檢測(cè)手段可以加以利用，因此，必要時(shí)也可以同時(shí)采用免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行判斷，以確保診斷無(wú)誤。

作者:張文璇 曲庭偉 方程 金鑫 嚴(yán)昌國(guó) 單位:延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系 東北寒區(qū)肉牛科技創(chuàng)新教育部工程研究中心 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系