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1材料與方法

試驗(yàn)動(dòng)物選用5只成年太行青山羊公羊，對(duì)其實(shí)施閹割手術(shù)，采集睪丸組織，放入已處理過(guò)的凍存管后投入液氮保存。RNA提取依照說(shuō)明書(shū)操作要求提取山羊睪丸總RNA，通過(guò)核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)純度、濃度及和，然后瓊脂糖變性電泳檢測(cè)RNA的完整性，貯存于－80℃冰箱。1．3引物設(shè)計(jì)根據(jù)中公布的人、鼠、牛、綿羊基因同源序列的序列進(jìn)行分析，在高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)擴(kuò)增序列特異性引物SP1，5’RACE和3’引物根據(jù)生物公司．試劑盒操作說(shuō)明要求，通過(guò)Primer5．0軟件設(shè)計(jì)，引物交由上海生物工程公司合成，試驗(yàn)所用引物序列?；蛉L(zhǎng)c克隆基因cDNA中間片段克隆使用SYBR?中的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建10μL反轉(zhuǎn)錄體系：．5μL，R；反應(yīng)條件：。mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA后用作后續(xù)PCR模板，擴(kuò)增引物SP1，構(gòu)建15μL體系：cDNA模板聚合酶；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min。反應(yīng)結(jié)束后1％的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。和5’RACE擴(kuò)增以提取的山羊睪丸組織總RNA為模板，嚴(yán)格按照TaKaRa生物公司試劑盒說(shuō)明進(jìn)行3’RACE和5’RACE擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)割膠回收、連接轉(zhuǎn)化、定向克隆至，測(cè)序。序列分析分段擴(kuò)增及RACE獲得的山羊基因序列利用DNAStar軟件中的SeqMan程序拼接，拼接產(chǎn)物（核酸序列）用DNAStar軟件中的EditSeq程序翻譯成氨基酸序列。并通過(guò)

2結(jié)果與分析

基因cDNA特異片段及RACE擴(kuò)增結(jié)果本試驗(yàn)從成年太行青山羊睪丸組織提取的RNA進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成，然后以山羊睪丸cDNA第一鏈為模板，用R引物進(jìn)行擴(kuò)增基因cDNA特異性片段，產(chǎn)物經(jīng)1．2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外燈下成像分析，觀察到一條帶，為900bp左右，與預(yù)期的目的條帶大小相符，說(shuō)明擴(kuò)增成功。以合成的RACEcDNA為模板，通過(guò)套式PCR反應(yīng)，3’RACE和5’RACE分別擴(kuò)增得到約250bp、1000bp的片段（圖1），將所得產(chǎn)物進(jìn)行純化，與pMD18－T載體連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，篩選單克隆質(zhì)粒后送上海生工測(cè)序，經(jīng)結(jié)果表明，該序列屬于基因3’端和5’端序列?；騝DNA全長(zhǎng)序列分析結(jié)果cDNA全長(zhǎng)序列的獲得用DNAS－TAR軟件SeqMan程序?qū)T－PCR和RACE產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接分析，山羊cDNA全長(zhǎng)序列為，包含有960bp的開(kāi)放閱讀框，編碼319個(gè)氨基酸。該基因3’非翻譯區(qū)長(zhǎng)87bp，3’非翻譯區(qū)有真核生物典型的PolyA加尾結(jié)構(gòu)。功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)應(yīng)用SMART服務(wù)器分析對(duì)結(jié)構(gòu)域功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在319個(gè)氨基酸序列中，73到115之間有一個(gè)“pKID”區(qū)域，259～316之間含有一個(gè)典型的“BRLZ”結(jié)構(gòu)，說(shuō)明屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族?？缒^(qū)分析用ExPASy提供的在線TM－HMM跨膜區(qū)預(yù)測(cè)軟件分析山羊氨基酸序列未發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)。二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)通過(guò)GOR方法對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果如圖5顯示，山羊蛋白由α－螺旋（約占37．30％），β－折疊（約占18．81％）和卷曲螺旋3種模塊組成，以α－螺旋和卷曲螺旋為主三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)通過(guò)SWISS－MODEL軟件在線預(yù)測(cè)所推導(dǎo)的山羊蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。以PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的1kdxB（99．9）被選定為模板，待測(cè)蛋白質(zhì)與模板的序列相似性達(dá)到88．889％，建模的氨基酸由82～108，評(píng)估值為2．33172e－05，符合建模標(biāo)準(zhǔn)。預(yù)測(cè)模型。可見(jiàn)，山羊蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)包括兩個(gè)核心螺旋。運(yùn)用Swiss－PdbViewer軟件進(jìn)行模型質(zhì)量評(píng)價(jià)。圖8為預(yù)測(cè)3D模型的拉氏構(gòu)象圖。從結(jié)果可以看出，氨基酸在拉氏構(gòu)象圖中較集中的位置形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，基本判斷3D模型是合理的。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示螺旋結(jié)構(gòu)的全部氨基酸在第三象限的黃色區(qū)域內(nèi)，說(shuō)明模型可信度高。序列多重比對(duì)和分子進(jìn)化樹(shù)分析將山羊基因編碼區(qū)核苷酸和氨基酸序列分別與GenBank中已登錄的牛、綿羊、狗、人、褐鼠的基因進(jìn)行比較，結(jié)果顯示核苷酸同源性分別為，氨基酸同源性分別為。并用基于氨基酸序列的NJ法構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示山羊與牛親緣關(guān)系最近，人次之，與小鼠、褐鼠、馬、狗和綿羊的親緣關(guān)系較為相近，與鮭魚(yú)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3討論

自1991年Foulkes等首次獲得小鼠基因cDNA序列，隨后許多物種的基因cD－NA序列被成功克隆。本研究通過(guò)RACE技術(shù)成功克隆得到全長(zhǎng)1183bp山羊基因cDNA序列，包含有960bp的開(kāi)放閱讀框，編碼319個(gè)氨基酸。該基因3’非翻譯區(qū)長(zhǎng)87bp，3’非翻譯有真核生物典型的PolyA加尾結(jié)構(gòu)。3’非翻譯區(qū)有一個(gè)“ATTTA”序列，與RNA的穩(wěn)定性有關(guān)。山羊基因cDNA序列與牛相似，3’非翻譯區(qū)僅存在一個(gè)PolyA位點(diǎn)，區(qū)別于小鼠等其他哺乳動(dòng)物基因的3’末端的兩個(gè)polyA位點(diǎn)。對(duì)氨基酸序列預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)包含兩個(gè)富含谷氨酸結(jié)構(gòu)域，一個(gè)PKA磷酸化位點(diǎn)，以及一個(gè)堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，均屬于CREB亞族典型的功能結(jié)構(gòu)域，表明本研究克隆出的基因cDNA序列及氨基酸序列屬于典型的bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族。通過(guò)應(yīng)用SMART服務(wù)器對(duì)結(jié)構(gòu)域功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在319個(gè)氨基酸序列中，73～115之間有一個(gè)“pKID”區(qū)域，259～316之間含有一個(gè)典型的“BRLZ”結(jié)構(gòu)，pKID區(qū)域?yàn)榧っ刚T導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，是蛋白激酶對(duì)蛋白進(jìn)行磷酸化的部位，是激活蛋白必不可少的區(qū)域“BRLZ”結(jié)構(gòu)為bZIP結(jié)構(gòu)域，其主要作用是調(diào)控蛋白／DNA的相互作用，二聚化是蛋白結(jié)合DNA所必需的，二聚化的蛋白與CRE啟動(dòng)子元件結(jié)合?，F(xiàn)已證實(shí)，許多參與精子發(fā)生過(guò)程的基因，其啟動(dòng)子位點(diǎn)均含有CREs。因此，bZIP區(qū)對(duì)發(fā)揮正常的生物學(xué)功能是必需的，而且也是保守的。CDS序列同源性分析結(jié)果表明，與牛、綿羊、狗、人和褐鼠同源性分別為，氨基酸序列同源性分別為，說(shuō)明在進(jìn)化過(guò)程中具有較高的保守性。蛋白質(zhì)的生物功能很大程度上取決于其空間結(jié)構(gòu)，致使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)成為了目前研究的熱門(mén)課題。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，山羊蛋白有α－螺旋、β－折疊和卷曲螺旋3種模塊，以α－螺旋和卷曲螺旋為主。通過(guò)同源建模，與PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中1kdxB（99．9A）三維結(jié)構(gòu)高度相似，通過(guò)的三級(jí)結(jié)構(gòu)和拉氏構(gòu)象圖同樣也驗(yàn)證了蛋白結(jié)構(gòu)非常保守。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)山羊cDNA序列成功克隆，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為后續(xù)深入探討山羊蛋白生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。

作者：施力光荀文娟張春香單位：中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院