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1概述

2代載體（YAC、BAC、PAC）YAC載體能夠攜帶的動物片段長度為900～1000kb；植物片段的長度為100～350kb，用YAC構建的基因組文庫只需要較少的克隆就可以覆蓋整個基因組。Phan等利用電擊法將YAC轉入番茄中，并在番茄中獲得了穩(wěn)定的轉基因細胞系，Adam等［5］、Flynn等［6］將同樣的方法應用在煙草中，但是YAC的穩(wěn)定性差、操作不便、具有自身難以克服的缺點［7－8］。BAC載體能攜帶的外源dnA長度為100～350kb，容量沒有YAC大，但相比之下BAC擁有更多的優(yōu)點。Choi等用pBACwich載體構建了棉花的BAC文庫，并利用基因槍法使一部分克隆轉化到煙草中，證明了外源DNA片段可整合到染色體的特定位點上。Song等將從高粱中獲得的90kb的BAC克隆利用基因槍法成功轉入到玉米中，并在玉米后代中檢測到外源基因的高效表達。Ioannou等構建了1個P1載體（pCYPAC－1），并通過電穿孔法將重組DNA轉入到大腸桿菌中。這個新型的克隆載體能夠承載平均大小為130～150kb的片段，并且沒有明顯的嵌合和缺失現(xiàn)象，因此可以用來繪制物理圖譜和分析復雜的基因組。日本水稻基因組計劃就是用PAC文庫構建的物理圖譜。Hamilton等［設計了1個既可以承載重組質粒又可以轉化植物的載體即雙元細菌人工染色體（BIBAC），這一載體可將大片段轉入植物中，并成功的將150kb的人類基因組DNA通過農桿菌介導的方法轉入到煙草中，通過對轉化煙草后代的鑒定發(fā)現(xiàn)此外源基因可以穩(wěn)定的遺傳表達。Hamilton等［構建了世界上第1個番茄的大片段BIBAC文庫。大片段的基因組文庫的構建，使很多全長基因的篩選和獲得均成為可能。目前，已知的以BIBAC為載體構建的文庫有煙草、番茄、擬南芥、水稻、藥用野生稻、大豆及人參。這一載體是大片段DNA轉化植物最為有用的載體。可轉化人工染色體（TAC）為加快從植物基因分離定位克隆，這就要求載體系統(tǒng)要適應于染色體步移和遺傳互補，因此，Liu等構建了可轉化的人工染這一載體系統(tǒng)能夠保證大片段DNA在大腸桿菌和農桿菌中都保持穩(wěn)定，并運用這一載體獲得了轉基因擬南芥以及轉基因水稻，這一載體的出現(xiàn)彌補了YAC、BAC在定位克隆研究中的缺陷。

2大片段DNA制備技術

通過使用96孔板作為提取容器，將研磨后的植物樣本放入不同孔中進行提取，1人1d可提取近千個樣本。大片段DNA遺傳轉化的方法及其影響因素當前根據(jù)有無載體可將轉化方法分為2類：1類是以質粒DNA等為媒介的遺傳轉化，即將目的基因插入到農桿菌的質粒等載體上，伴隨著質粒DNA的轉移將目的基因轉入到植物中，如葉盤法、原生質體法、真空滲入法、脂質體法等；另1類為不需要載體的轉化方法，如基因槍法、花粉管通道法、電擊法、微注射法、聚乙二醇法、硅化纖維法等。1982年通過農桿菌介導的方法獲得了全世界第1株轉基因植物煙草，這標志著轉基因時代的全面到來。目前農桿菌介導法應用依然最廣，在獲得的百余種轉基因植物中，有80％是通過農桿菌介導的方法獲得的。菌種和宿主范圍農桿菌菌株種類很多，每種菌種所具有的毒力也就是侵染能力各不相同，因此每種菌種都有其適宜侵染的最適合宿主。一般而言，農桿菌菌種侵染能力強弱依次為農桿堿型菌株、胭脂堿型菌株、章魚堿型菌株。農桿菌堿型菌株有EHA胭脂堿型菌株有C58、GV3101，章魚堿型菌株有LBA4404、Ach5，選擇對受體植物較為敏感的菌株是轉化成功的重要因素。同一種植物對不同菌株的敏感程度也不相同，如Hiei等在對水稻的研究中發(fā)現(xiàn)，EHA101（pTOK233）不如LB4404（pTOK233）效果好；在西瓜中，EHA105的侵染能力明顯優(yōu)于LBA4404和AGL－1，轉化率可達76．7％。農桿菌宿主范圍廣泛，可轉化許多雙子葉植物、單子葉植物和裸子植物，此外，農桿菌也可以轉化真菌，如酵母、子囊菌和擔子菌。近期的報道農桿菌將DNA轉化到了人類細胞。

作者:石玉蔣世翠張美萍孫春玉王康宇王義單位：吉林農業(yè)大學