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nk細(xì)胞范文第1篇

異基因造血干細(xì)胞移植后，供者細(xì)胞可產(chǎn)生強(qiáng)大而持久的免疫治療功效，其中異源反應(yīng)性nk細(xì)胞活性是T細(xì)胞異源反應(yīng)活性以外的，具有顯著抗腫瘤/白血病活性的自然免疫現(xiàn)象，并逐漸受到人們的重視。已證實(shí)，NK細(xì)胞通過(guò)其受體與靶細(xì)胞MHC分子特異性的識(shí)別機(jī)制參與移植物抗白血?。℅VL）作用并影響移植物抗宿主?。℅VHD）的發(fā)生。異基因造血干細(xì)胞移植后異源反應(yīng)性NK細(xì)胞輸注已從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)逐漸應(yīng)用于臨床。本文就NK細(xì)胞異源反應(yīng)性及其在異基因造血干細(xì)胞移植中的作用進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】 異基因造血干細(xì)胞移植；NK細(xì)胞；移植物抗白血??；移植物抗宿主病

Role of NK Cells in Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation ——Review

Abstract

After allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT)，the donor cells present a profound immunization therapy efficiency. Among these effector cells，allo-reactivity natural killer (NK) cell activation are concerned with the graft-versus-host disease (GVHD) and graft-versus-leukemia (GVL) effect . As known，GVHD is primarily a T-cell-mediated event but not initiated by NK cells. NK cells may significantly enhance GVL immune response by using an integration of activating and inhibitory receptors. Allo-reactivitive NK cell infusion after allo-HSCT already transits from experiments to clinic. In this review the background on NK cells，and their clinical roles in Allo-HSCT were summarized.

Key words

allogeneic hematopoietic stem cell transplantation; natural killer cell; graft-versus-leukemia; graft-versus-host disease

異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)是治療多種惡性病及一些非惡性病的有效方法，尤其在治療急性白血病方面，可使50%患者長(zhǎng)期無(wú)病生存。研究發(fā)現(xiàn)，異基因造血干細(xì)胞移植后，供者免疫系統(tǒng)在受者體內(nèi)的重建可產(chǎn)生移植物抗白血?。╣raft versus leukemia，GVL）作用，但也產(chǎn)生危及患者生命的移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）及遲發(fā)的免疫功能障礙。隨著對(duì)NK細(xì)胞功能及活化機(jī)制的了解，其在allo-HSCT后造血重建及免疫重建中的作用越來(lái)越受到重視。許多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察均提示allo-HSCT后，供者NK細(xì)胞的異源反應(yīng)活性通過(guò)促進(jìn)植入、阻止T細(xì)胞介導(dǎo)的GVHD、攻擊宿主白血病細(xì)胞發(fā)揮GVL效應(yīng)。上述現(xiàn)象最初發(fā)現(xiàn)于單倍不相合移植，而后研究提示在HLA相合有血緣關(guān)系及非血緣關(guān)系供者移植中均有體現(xiàn)［1，2］。但最近國(guó)外也有研究發(fā)現(xiàn)，KIR-配體不相合引起的NK細(xì)胞異源反應(yīng)性與移植相關(guān)死亡率（transplantation related mortality，TRM）升高及總存活率下降有關(guān)［3，4］，故在這方面的研究仍是熱點(diǎn)，存在許多爭(zhēng)議。本文就NK細(xì)胞異源反應(yīng)性的形成機(jī)制、NK細(xì)胞在allo-HSCT中的作用等問(wèn)題的研究新進(jìn)展綜述如下。

NK細(xì)胞群

NK細(xì)胞及來(lái)源

NK細(xì)胞是淋巴細(xì)胞譜系中不同于T、B淋巴細(xì)胞的一類大顆粒淋巴細(xì)胞，其代表性表型為CD3-、CD56+、CD16+。它是天然免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，無(wú)需抗原預(yù)先致敏，與靶細(xì)胞混合后4小時(shí)內(nèi)即可發(fā)揮殺傷作用，表現(xiàn)為速發(fā)效應(yīng)，因此位于機(jī)體抵御腫瘤和病毒感染的第一道防線，同時(shí)又能通過(guò)早期分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子來(lái)調(diào)節(jié)獲得性免疫，故也是連接天然免疫與獲得性免疫的橋梁［5，6］，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、造血調(diào)控、抗腫瘤和抗感染等方面發(fā)揮著重要的作用。Cooper等［7］根據(jù)NK細(xì)胞上CD56分子表達(dá)密度的不同將NK細(xì)胞分為CD56bright和CD56dim兩個(gè)亞群，在正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞主要參與NK細(xì)胞細(xì)胞毒作用。NK細(xì)胞來(lái)源于骨髓CD34+造血干細(xì)胞，其發(fā)育、成熟需要骨髓微環(huán)境包括骨髓基質(zhì)及其來(lái)源的細(xì)胞因子。NK細(xì)胞與T細(xì)胞來(lái)自同一祖細(xì)胞，這種分化上的親緣性可能解釋了NK細(xì)胞活化也受協(xié)同刺激信號(hào)的影響，及胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路與T細(xì)胞極為相似等現(xiàn)象。但與T細(xì)胞不同，NK細(xì)胞的發(fā)育成熟不依賴于胸腺，在骨髓微環(huán)境中，IL15與其配體C-kit（KL）和flt-3（FL）的協(xié)同作用是NK細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵生理調(diào)節(jié)因素，在其最初發(fā)育期，NK祖細(xì)胞在早期基質(zhì)細(xì)胞活化生長(zhǎng)因子KL、FL作用下發(fā)育為NK細(xì)胞前體，該前體細(xì)胞在IL-15作用下發(fā)育成熟為功能性NK細(xì)胞。

NK細(xì)胞受體及殺傷活性調(diào)節(jié)

NK細(xì)胞功能的發(fā)揮主要依賴于其識(shí)別靶細(xì)胞的受體。它有兩種受體：一類是激發(fā)NK細(xì)胞殺傷作用的殺傷細(xì)胞活化受體（killer activatory receptor，KAR），如CD94/NKG2C、NKP-P1、KIR-3Dshort；另一類是抑制NK細(xì)胞殺傷作用的殺傷細(xì)胞抑制受體（killer inhibitory receptor，KIR），如CD94/NKG2A、KIR-3Dlong。按分子結(jié)構(gòu)，也可將與NK細(xì)胞殺傷作用相關(guān)的受體分為免疫球蛋白樣受體（immunoglobulin-like receptor）和凝集素樣受體(lectin-like receptor)。一般認(rèn)為，NK細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)活化和抑制受體，其殺傷功能取決于表面抑制性受體與活化受體所傳遞信號(hào)的綜合。抑制性受體KIR的配體為MHC-Ⅰ類分子。由于抑制性受體與其配體結(jié)合的親和力大于活化受體，因此通常以抑制性信號(hào)占優(yōu)勢(shì)。正常情況下，機(jī)體組織細(xì)胞表面表達(dá)自身MHC-Ⅰ類分子，NK細(xì)胞KIR識(shí)別自身MHC-Ⅰ類分子，產(chǎn)生殺傷抑制信號(hào)，該信號(hào)在胞內(nèi)起主導(dǎo)作用，能阻斷殺傷信號(hào)的傳遞，表現(xiàn)為自身組織細(xì)胞不被破壞。只有當(dāng)靶細(xì)胞表面MHC-Ⅰ類分子表達(dá)降低、丟失或發(fā)生變異（如細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化、病毒感染等）時(shí)，NK細(xì)胞才能活化并啟動(dòng)殺傷作用，此即NK細(xì)胞的丟失自我（missing self）識(shí)別模式，即“殺傷自身MHC抗原減少或消失的細(xì)胞”［8］。

異基因造血干細(xì)胞移植中的NK細(xì)胞作用

NK細(xì)胞的“有利作用”

在異基因造血干細(xì)胞移植中，根據(jù)上述“丟失自我機(jī)制”，大部分情況下供者NK細(xì)胞KIR與受者靶細(xì)胞MHC分子的特異性識(shí)別表現(xiàn)為KIR-配體不相合性（少數(shù)情況下供受者KIR基因可能相合），可激活供者NK細(xì)胞，產(chǎn)生異源反應(yīng)性NK細(xì)胞。KIR-配體不相容性與供者NK細(xì)胞的異源反應(yīng)性密切相關(guān)。研究證實(shí)，此機(jī)制已參與移植物的植入、GVL作用及GVHD的發(fā)生，并對(duì)異基因造血干細(xì)胞移植產(chǎn)生有利影響，現(xiàn)分述如下。

NK 細(xì)胞與移植物的植入

無(wú)論供者、受者NK細(xì)胞都對(duì)移植物的植入有一定影響。受者方面，盡管在鼠類的研究顯示了抗放射性宿主NK細(xì)胞在抵抗骨髓植入中的重要性，但臨床干細(xì)胞移植中宿主NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗植入現(xiàn)象卻很有限。移植前抑制受者免疫的強(qiáng)化處理方案及大量植入的干細(xì)胞數(shù)量可基本抵消受者NK細(xì)胞的抗植入作用。供者方面，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，allo-HSCT過(guò)程中供者異源反應(yīng)性NK細(xì)胞可主動(dòng)攻擊宿主細(xì)胞，輔助供者干細(xì)胞成功植入。供者來(lái)源的NK細(xì)胞（無(wú)論是原本存在于移植物中的還是由植入干細(xì)胞新分化發(fā)育的）都對(duì)促進(jìn)植入有重要作用。當(dāng)供受者KIR不相合引發(fā)供者NK細(xì)胞異源反應(yīng)性時(shí)，供者NK 細(xì)胞通過(guò)識(shí)別殺傷受者殘留淋巴細(xì)胞和造血細(xì)胞而發(fā)揮強(qiáng)有力的促植入作用［9］。Peters等［10］的臨床研究發(fā)現(xiàn)，5例高危急性白血病患者經(jīng)單倍相合異基因造血干細(xì)胞移植后，輸注純化的供者NK細(xì)胞可增加穩(wěn)定嵌合體的形成，進(jìn)一步證實(shí)了供者NK細(xì)胞可鞏固移植物植入。

NK細(xì)胞與GVHD

GVHD的發(fā)生主要由T細(xì)胞介導(dǎo)。這一過(guò)程始于供者T細(xì)胞伴隨造血干細(xì)胞進(jìn)入受者體內(nèi)與受者抗原相遇。啟動(dòng)GVHD的關(guān)鍵的第一步是抗原呈遞細(xì)胞（APC）向供者CD8+T細(xì)胞呈遞主要和次要組織相容性抗原。NK細(xì)胞并不引發(fā)GVHD。研究發(fā)現(xiàn)，在鼠類供受者H-2相合但仍可發(fā)揮供者NK細(xì)胞異源反應(yīng)性的干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)中，無(wú)GVHD出現(xiàn)，而且給受體鼠大劑量輸注不相合NK細(xì)胞克隆也不引發(fā)GVHD［11］。進(jìn)一步在臨床移植觀察中，單倍相合的allo-HSCT后的供者NK細(xì)胞輸注是可耐受的，并不導(dǎo)致GVHD。然而，由于GVHD誘發(fā)的細(xì)胞表面分子上調(diào)并通過(guò)NKG2D配體激活NK細(xì)胞，使得NK細(xì)胞可能促進(jìn)靶細(xì)胞的損傷。另一方面，在HLA不相合干細(xì)胞移植中，供者NK細(xì)胞可通過(guò)表達(dá)LFA-1（淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1，是一種黏附分子，介導(dǎo)NK細(xì)胞與靶細(xì)胞結(jié)合）的造血系統(tǒng)特異靶細(xì)胞減輕GVHD。供者異源反應(yīng)性NK細(xì)胞可于輸注后數(shù)小時(shí)之內(nèi)殺滅受者淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞及APC［11］。理論上APC為啟動(dòng)GVHD所需，故輸注異源反應(yīng)性NK細(xì)胞應(yīng)可以減輕GVHD。臨床研究數(shù)據(jù)支持這一假說(shuō)：在單倍相合和非親緣供者異基因造血干細(xì)胞移植中，存在NK細(xì)胞異源反應(yīng)性的供-受者的GVHD發(fā)生率確實(shí)低于KIR相合者［12］。

轉(zhuǎn)貼于 　　NK細(xì)胞與GVL

在相同預(yù)處理?xiàng)l件下，allo-HSCT治療惡性血液病的復(fù)發(fā)率低于自體造血干細(xì)胞移植。目前認(rèn)為，其主要原因是異源反應(yīng)性NK細(xì)胞、T細(xì)胞所產(chǎn)生的GVL效應(yīng)［13］。NK 細(xì)胞與T細(xì)胞的異體反應(yīng)性的區(qū)別顯示，在HLA不相合移植中T細(xì)胞是GVHD的主要效應(yīng)細(xì)胞，而NK細(xì)胞在移植物植入及GVL中起主要作用。前面已提到造血細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的攻擊很敏感，根據(jù)“丟失自我”識(shí)別模式，當(dāng)NK細(xì)胞遇到KIR不相容的白血病細(xì)胞（靶細(xì)胞）時(shí)，就會(huì)顯示出強(qiáng)大的細(xì)胞毒作用，而在KIR相合或自體造血干細(xì)胞移植中無(wú)此作用。將人類異源反應(yīng)性NK細(xì)胞克隆輸注到已植入人AML細(xì)胞轉(zhuǎn)染性NOD/SCID小鼠D的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：未治療組及給予人無(wú)異源反應(yīng)性NK細(xì)胞克隆組小鼠均于3周內(nèi)死亡；而輸入人異源反應(yīng)性NK細(xì)胞組（即使輸入的細(xì)胞數(shù)很少），這些異源反應(yīng)性NK細(xì)胞即可清除白血病細(xì)胞并使小鼠存活120天。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床移植均證實(shí)由KIR不相合產(chǎn)生的異源反應(yīng)性NK細(xì)胞是allo-HSCT預(yù)后的有利因素。

NK細(xì)胞的“不利影響”

如前所述，異源反應(yīng)性NK細(xì)胞在allo-HSCT中有許多有利作用，目前這方面的理論研究及臨床實(shí)踐很多。但近期一些臨床研究也得出一些KIR-配體不相合引起的異源反應(yīng)性NK細(xì)胞對(duì)移植的不良影響。一方面，Ruggeri等［14］最近仍報(bào)道單倍相合造血干細(xì)胞移植后，異源反應(yīng)活性NK細(xì)胞介導(dǎo)的供者抗受者異源性反應(yīng)可減少AML患者復(fù)發(fā)危險(xiǎn)，改善植入，減輕GVHD；并進(jìn)一步提出臨床應(yīng)用中可通過(guò)供者及受者高分辨HLA基因配型，積極鑒定供者KIR基因，甚至在一些病例中根據(jù)供者NK細(xì)胞克隆功能評(píng)價(jià)選擇單倍體供者，均可能有助于增強(qiáng)鞏固供者抗受者的NK細(xì)胞異源反應(yīng)性。但另一方面，Nguyen等［15］在10例AML經(jīng)單倍相合造血干細(xì)胞移植患者中研究移植后的NK細(xì)胞重建，發(fā)現(xiàn)盡管10例中8例KIR配體不相合，10例AML患者單倍相合造血干細(xì)胞移植后NK細(xì)胞恢復(fù)中未觀察到GVL效應(yīng)。且干細(xì)胞移植后產(chǎn)生的NK細(xì)胞表現(xiàn)出不成熟的表型：細(xì)胞毒性CD3(-) CD56(dim)亞型很少，表達(dá)KIR、NKp30 減少，而表達(dá)CD94/NKG2A增加。這些結(jié)果揭示，單倍相合干細(xì)胞移植后產(chǎn)生的NK 細(xì)胞 被阻滯在一種具有特殊表型特點(diǎn)的非成熟階段，功能不全，對(duì)免疫應(yīng)答及抑制恢復(fù)有潛在影響。不成熟的NK細(xì)胞，及NKG2A的抑制作用減輕了GVL效應(yīng)。同時(shí)，Malmberg等［3］，Schaffer等［4］在190例非親緣供者造血干細(xì)胞移植中（KIR-配體不相合者167例，相合者23例）的最新研究發(fā)現(xiàn)，KIR-配體不相合引起的NK細(xì)胞異源反應(yīng)性與TRM升高及總存活率下降有關(guān)。這主要由嚴(yán)重感染引起，考慮由KIR-配體不相合引起的同種異源反應(yīng)性NK細(xì)胞的存在可能潛在地阻礙了機(jī)體對(duì)移植后早期感染的有效免疫。目前看來(lái)，allo-HSCT后的造血重建與免疫重建非常復(fù)雜，其中NK細(xì)胞作用有待進(jìn)一步探討。伴隨供者干細(xì)胞進(jìn)入受者體內(nèi)的成熟NK細(xì)胞與由供者干細(xì)胞在受者體內(nèi)逐漸發(fā)育分化而來(lái)的NK細(xì)胞對(duì)移植后免疫是否有不同的影響，仍需進(jìn)一步研究；同時(shí)，KIR-配體不相合在移植中的意義有待進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

臨床展望

從臨床應(yīng)用來(lái)說(shuō)，雖然對(duì)于異源反應(yīng)性NK細(xì)胞在allo-HSCT中的作用仍存在許多爭(zhēng)議，但根據(jù)其有利的作用，供者NK細(xì)胞輸注已從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究開始逐漸用于臨床，目前報(bào)道未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)［10］。對(duì)臨床治療思路有幾方面啟示： 首先，移植前進(jìn)行供受者HLA配型并結(jié)合KIR基因鑒定，盡可能為選擇更合適的供者提供依據(jù)；其次，NK細(xì)胞可加速APC從受者骨髓、脾臟等部位的清除，減輕GVHD，因而可無(wú)需使用針對(duì)T細(xì)胞的免疫抑制處理方法，這為降低GVHD發(fā)生設(shè)計(jì)了另類策略［16，17］。再次，聯(lián)合供者異源反應(yīng)性NK細(xì)胞輸注，有望降低異基因造血干細(xì)胞預(yù)處理強(qiáng)度，更進(jìn)一步擴(kuò)大適應(yīng)癥范圍，使得高齡及臨床狀況差的患者也得到治療機(jī)會(huì)。

結(jié)語(yǔ)

隨著對(duì)移植免疫學(xué)及NK細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生機(jī)制的深入研究，人們對(duì)NK細(xì)胞在allo-HSCT中的作用逐漸了解。NK細(xì)胞受體（NKR）中KIR與配體（MHC-Ⅰ類分子）的不相合是激活NK細(xì)胞殺傷作用、在異基因移植中產(chǎn)生異源反應(yīng)性NK細(xì)胞的關(guān)鍵，因此這也成為目前研究的熱點(diǎn)。大部分研究結(jié)果顯示，異源反應(yīng)性NK細(xì)胞有利于異基因造血干細(xì)胞植入，可減少GVHD，并發(fā)揮GVL作用。但對(duì)移植后免疫重建及患者總生存率的影響研究較少，臨床病例也缺乏長(zhǎng)期觀察，故這些方面還有待進(jìn)一步闡明。在臨床治療中，純化供者NK細(xì)胞的輸注已在干細(xì)胞移植及惡性實(shí)體瘤生物治療等方面取得了良好效果，并對(duì)干細(xì)胞移植治療策略產(chǎn)生了重大影響。如何更好的發(fā)揮NK細(xì)胞功能，將是allo-HSCT治療及腫瘤免疫治療的研究重點(diǎn)。

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nk細(xì)胞范文第2篇

題目：表觀遺傳學(xué)調(diào)控NK細(xì)胞分化及功能的研究進(jìn)展

表觀遺傳學(xué) (epigenetics) 是指在基因核苷酸序列不發(fā)生變化的情況下, 通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控使基因表達(dá)發(fā)生變化, 包括DNA甲基化、組蛋白共價(jià)修飾、染色質(zhì)重塑、基因印記、及非編碼RNA、微小RNA (miRNA) 、反義RNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等[1]。環(huán)境、年齡改變、壓力、疾病狀態(tài)等, 均可以引起免疫細(xì)胞表觀遺傳學(xué)改變, 造成免疫系統(tǒng)功能紊亂, 導(dǎo)致疾病的發(fā)生與進(jìn)展。因此, 表觀遺傳學(xué)逐漸成為免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。

自然殺傷細(xì)胞 (natural killer cell, NK) 是天然免疫細(xì)胞, 主要來(lái)源于造血干細(xì)胞, 全身廣泛分布。NK細(xì)胞通過(guò)一系列細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程獲得激活信號(hào), 包括胞外鈣離子內(nèi)流、細(xì)胞骨架重排以及與靶細(xì)胞接觸部位免疫突觸形成, 最終通過(guò)分泌細(xì)胞因子、趨化因子及釋放毒性顆粒執(zhí)行清除病毒、腫瘤細(xì)胞以及發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。NK細(xì)胞功能異常導(dǎo)致多種疾病發(fā)生, 包括感染、腫瘤及自身免疫疾病[2,3]。近年來(lái), 有很多學(xué)者先后報(bào)道了表觀遺傳學(xué)改變對(duì)NK細(xì)胞增殖、分化及功能的影響, 為NK細(xì)胞研究提供了新思路, 為新藥的臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。本文對(duì)NK細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展作一綜述。

1 表觀遺傳學(xué)對(duì)NK細(xì)胞分化的影響

人類NK細(xì)胞表面特異性表達(dá)CD56或CD16分子, 根據(jù)其表達(dá)水平將NK細(xì)胞分為CD3-CD56bright CD16- (CD56bright) 、CD3-CD56dimCD16+ (CD56dim) 、CD3-CD56-CD16+3個(gè)亞群[4]。其中CD56bright亞群為調(diào)節(jié)性NK細(xì)胞, 可以參與適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié), 通過(guò)分泌細(xì)胞因子和趨化因子 (IFN-、TNF-、IL-10、IL-13和GM-CSF) 對(duì)樹突狀細(xì)胞 (DCs) 、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (Tregs) 、輔T細(xì)胞 (Ths) 及細(xì)胞毒性T細(xì)胞 (CTLs) 等進(jìn)行免疫調(diào)控[5]。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中, NK細(xì)胞可以通過(guò)分泌IFN-誘導(dǎo)B細(xì)胞活化, 促進(jìn)DC細(xì)胞成熟, 并可抑制T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化[6]。NK細(xì)胞分泌IFN-可以促進(jìn)DC細(xì)胞分泌IL-27, 而IL-27可促進(jìn)IFN-分泌, 這種正反饋參與抑制Th17介導(dǎo)的自身免疫疾病[7]。人和小鼠NK細(xì)胞均可通過(guò)分泌IFN-可以抑制CD4+T細(xì)胞向Tregs分化[8]。CD56dim為功能性NK細(xì)胞, 通過(guò)穿孔素/顆粒酶途徑、Fas/FasL途徑、TNF-а/TNFR-1途徑、以及抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用 (ADCC) 完成對(duì)靶細(xì)胞的直接殺傷。近期也有研究者發(fā)現(xiàn), 功能性NK細(xì)胞參與適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié), 直接殺傷適應(yīng)性免疫細(xì)胞, 如Th17及濾泡輔T細(xì)胞 (Tfh) [9]。而CD3-CD56-CD16+亞群目前研究較少, 目前認(rèn)為主要發(fā)揮ADCC作用。

表觀遺傳學(xué)修飾在NK細(xì)胞的分化、成熟中發(fā)揮了重要作用。早期的研究顯示, IL-15受體信號(hào)通路對(duì)NK細(xì)胞的分化成熟至關(guān)重要, E4BP4 (NFIL3) 在其中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用, 促進(jìn)了造血干細(xì)胞 (HSC) 向NK細(xì)胞分化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示, E4BP4基因缺陷小鼠NK細(xì)胞減少、功能下降, 而過(guò)表達(dá)E4BP4可增加Id2和Gata3的轉(zhuǎn)錄, 從而促進(jìn)HSC向NK細(xì)胞分化增加[10]。在NK細(xì)胞發(fā)育中, 組蛋白甲基化也具有重要調(diào)控作用。Yin等[11]研究了zeste基因增強(qiáng)子同源物2 (EZH2) 對(duì)早期NK細(xì)胞分化的影響。EZH2作為重要的表觀遺傳修飾酶, 是PcG (polycomb group) 蛋白家族的重要成員, 在調(diào)控基因表達(dá)的過(guò)程中起關(guān)鍵作用[12]。EZH2主要對(duì)組蛋白H3K27進(jìn)行甲基化, 從而沉默下游基因, 在細(xì)胞增殖、分化及腫瘤形成方面都有重要作用[13]。研究者[11]發(fā)現(xiàn), 在小鼠及人中, 選擇性失活EZH2或用小分子抑制其活性后, 可以增加IL-15受體 (CD122+) 陽(yáng)性的NK祖細(xì)胞數(shù)量, 并促進(jìn)成熟NK細(xì)胞增殖。NK細(xì)胞的擴(kuò)增及殺傷作用還與CD122及NKG2D有關(guān), NKG2D缺失可降低EZH2抑制劑對(duì)促進(jìn)NK細(xì)胞增殖及分化的作用。另外, Tsuyama等[14]研究報(bào)道, NKT細(xì)胞淋巴瘤患者存在組蛋白去甲基化酶KDM6A基因突變, 此基因與血液腫瘤關(guān)系密切, 可能影響NK細(xì)胞的增殖。

FcRIIIA (CD16a) 由FCGR3A編碼, 為NK細(xì)胞在成熟過(guò)程中獲得。研究發(fā)現(xiàn), 在CD16a+細(xì)胞中, FCGR3A啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的甲基化水平較CD16a-細(xì)胞和中性粒細(xì)胞明顯降低。此外, 研究者還發(fā)現(xiàn)miR-218是NK細(xì)胞CD16a轉(zhuǎn)錄后的負(fù)調(diào)控因子。在NK細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)miR-218可降低CD16a的mRNA和蛋白表達(dá)水平, miR-218在CD16a-細(xì)胞中水平明顯高于CD16a+細(xì)胞。因此, 研究者推斷, FCGR3A的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)甲基化及轉(zhuǎn)錄后miR-218的調(diào)控作用可以通過(guò)改變CD16a的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的分化成熟[15]。

記憶性NK細(xì)胞的概念由Sun等[16]最早提出。這類NK細(xì)胞可以長(zhǎng)期存活, 具有免疫記憶功能, 當(dāng)再次接觸到記憶抗原時(shí)被激活。多種病毒可以誘導(dǎo)記憶性NK細(xì)胞產(chǎn)生, 目前報(bào)道的有巨細(xì)胞病毒, 單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒等[17,18]。記憶性NK細(xì)胞表達(dá)CD57和NKG2C, 不表達(dá)FcR、SYK、DAB2、ETA-2、PLZF和ILZF2。FcR、ETA-2、SYK的缺乏均有表觀遺傳學(xué)機(jī)制的參與[19,20]。IL-12信號(hào)通路通過(guò)其下游轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)和轉(zhuǎn)錄因子4 (STAT4) 的激活影響記憶性NK細(xì)胞的擴(kuò)增。Rapp等[21]發(fā)現(xiàn)Runx1和Runx3的啟動(dòng)子區(qū)域是STAT4的結(jié)合位點(diǎn), 在NK細(xì)胞活化過(guò)程中, STAT4的結(jié)合會(huì)誘導(dǎo)RUNX基因位點(diǎn)的表觀遺傳學(xué)修飾, 從而導(dǎo)致表達(dá)增加。在病毒感染中, Runx1和Runx3或它們的伴侶分子表達(dá)減低是影響NK細(xì)胞擴(kuò)增及記憶NK細(xì)胞形成障礙的原因。該研究證明, STAT4介導(dǎo)的Runx轉(zhuǎn)錄因子表觀遺傳學(xué)修飾可以調(diào)節(jié)NK細(xì)胞對(duì)病毒的適應(yīng)行為。

2 表觀遺傳學(xué)對(duì)NK細(xì)胞功能的影響

NK細(xì)胞的功能主要包括殺傷及免疫調(diào)節(jié)作用。有研究顯示, 在NK細(xì)胞活化過(guò)程中, 81%的主要位點(diǎn)出現(xiàn)CpG去甲基化, 生物學(xué)分析顯示差異甲基化位點(diǎn)主要集中在免疫調(diào)節(jié)功能中 (如TNFA、LTA、IL-13、CSF2等) [22], 這提示表觀遺傳學(xué)修飾參與了NK細(xì)胞的活化, 并與NK細(xì)胞功能關(guān)系密切。

2.1 表觀遺傳學(xué)修飾對(duì)NK細(xì)胞表面受體的調(diào)節(jié)作用

NK細(xì)胞表面激活性受體與抑制性受體的相互平衡, 在NK細(xì)胞功能中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用。如激活性受體表達(dá)占優(yōu), 則NK細(xì)胞活化, 反之, NK細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。

有學(xué)者[23,24,25]檢測(cè)了NK細(xì)胞免疫球蛋白樣受體 (KIR) 啟動(dòng)子的甲基化水平, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 處于靜息狀態(tài)的人NK細(xì)胞92細(xì)胞系中KIR2DL1、KIR2DL2/L3高甲基化, 同時(shí), 細(xì)胞表面的KIR表達(dá)降低。當(dāng)應(yīng)用5-氮雜胞苷進(jìn)行去甲基化處理后, KIR啟動(dòng)子去甲基化, NK細(xì)胞表面KIR表達(dá)明顯增加。另外, KIR的表達(dá)受miRNA調(diào)節(jié)。PIWI樣RNA可以誘導(dǎo)KIR雙向啟動(dòng)子KIR3DL1產(chǎn)生KIR反義轉(zhuǎn)錄本, 影響雙鏈DNA的合成, 可減少90%的KIR表達(dá)[25]。

NKG2D是NK細(xì)胞激活性受體, 其表達(dá)增加可增強(qiáng)NK細(xì)胞功能。NKG2D通過(guò)識(shí)別不同的配體家族 (MICA、MICB、ULBPs 1-6等) 參與激活效應(yīng)細(xì)胞、溶解靶細(xì)胞。NKG2D基因在NKG2D+NK細(xì)胞中去甲基化, 并與組蛋白H3賴氨酸9乙酰化 (H3K9Ac) 相關(guān)。用組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶 (HAT) 抑制劑 (姜黃素) 可以明顯下調(diào)NKG2D基因H3K9乙?；? 進(jìn)而下調(diào)NKG2D的轉(zhuǎn)錄, 導(dǎo)致NKG2D表達(dá)減低, NK細(xì)胞殺傷功能下降。此研究提示NKG2D在NK細(xì)胞表面表達(dá)差異是由表觀遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)節(jié)的, 并可以通過(guò)表觀遺傳治療改善[26]。組蛋白去乙?；敢种苿┍焖?(VPA) 通過(guò)激活基因啟動(dòng)子中組蛋白K9的高甲基化和DNA甲基化, 從而下調(diào)NKG2D的表達(dá)[27]。同樣, miRNA也可發(fā)揮對(duì)NKG2D的調(diào)節(jié)作用。在HCV感染患者的NK細(xì)胞中, miR-182與對(duì)照組相比過(guò)表達(dá), miR-182表達(dá)升高可降低NKG2D的mRNA水平, 而miR-182抑制劑能降低抑制性受體NKG2A的mRNA水平[28]。

2.2 表觀遺傳學(xué)修飾對(duì)NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌水平的調(diào)節(jié)作用

NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子同樣受到表觀遺傳學(xué)修飾的調(diào)節(jié)。Luetke-Eversloh等[29]報(bào)道, NK細(xì)胞受到刺激后, IFN-及T-bet位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄增加, 并發(fā)生去甲基化, 從而增加IFN-的分泌。Li等[30]發(fā)現(xiàn), 在NK細(xì)胞激活過(guò)程中, 組蛋白去甲基化酶及甲基轉(zhuǎn)移酶發(fā)生明顯變化。在NK92細(xì)胞系中, 與NK細(xì)胞激活密切相關(guān)的PI3KCA, 、NFATC1及TNFSF9等基因, 經(jīng)PMA和依諾霉素刺激可出現(xiàn)H3K4me3和H3K27甲基化修飾, 從而調(diào)控上述基因表達(dá)。采用H3K4和H3K37的特異性抑制劑可以增加NK細(xì)胞脫顆粒及IFN-、TNF-的分泌[22,30]。Cribbs等[31]用染色質(zhì)甲基化及乙?；男》肿右种苿┻M(jìn)行篩選, 并通過(guò)基因敲除方法確定了Jumonli型組蛋白H3K27脫甲基酶是NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。JMJD3/UTX (含有Jumonji結(jié)構(gòu)域的蛋白3) H3K27去甲基化酶抑制劑GSK-J4可引發(fā)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)H3K27甲基化, 并造成NK細(xì)胞IFN-、TNF-、GM-CSF、IL-10分泌下降。GSK-J4可以明顯抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血或組織中分離出的NK細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌, 抑制破骨細(xì)胞形成及骨破壞。除甲基化外, 組蛋白乙酰化修飾也對(duì)NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌起調(diào)節(jié)作用。VPA可抑制NK細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞的溶解, 并且有劑量依賴性。VPA預(yù)處理可降低NK細(xì)胞IFN-分泌, 破壞CD107A脫顆粒, 并通過(guò)激活PD-1/PD-L1途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]。

H3K4me3脫甲基酶KDM5A調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄并參與腫瘤的發(fā)生。Zhao等[32]研究證明KDM5A缺陷使IFN-產(chǎn)生減少, 并損害NK細(xì)胞的活化。KDM5A (-/-) 小鼠對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 (LM) 感染高度敏感。在NK細(xì)胞活化過(guò)程中, KDM5A的缺失影響STAT4磷酸化和核定位, 并增加了細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1 (SOCS1) 的表達(dá)。進(jìn)一步研究揭示其機(jī)制為KDM5A與P50結(jié)合, 并與靜止NK細(xì)胞中的SOCS1啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合, 抑制染色質(zhì)重塑, 導(dǎo)致在SOCS1啟動(dòng)子中H3K4me3修飾顯著減少。

另外, Lee等[19]在研究記憶性NK細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn), 人巨細(xì)胞病毒感染后, NK細(xì)胞Syk轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)甲基化, Syk基因沉默, 可引起表達(dá)IFN-水平升高。BHLHE40為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子, 在活化的NK細(xì)胞中去甲基化, 誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌 (如IL-2、IL-12、IL-15、IFN、TNFA等) , 增強(qiáng)NK細(xì)胞功能。NFAT轉(zhuǎn)錄因子家族通過(guò)與啟動(dòng)子及增強(qiáng)子區(qū)域結(jié)合來(lái)增加NK細(xì)胞因子的表達(dá)。在活化的NK細(xì)胞中, NFATC1內(nèi)含子9明顯去甲基化, 可調(diào)節(jié)NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子[22]。

3 引起NK細(xì)胞表觀遺傳學(xué)變化的因素

多種疾病狀態(tài)下, NK細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)修飾會(huì)發(fā)生變化, 如巨細(xì)胞病毒感染會(huì)激活NK細(xì)胞, 引起81%的位點(diǎn)發(fā)生DNA去甲基化[22]。在兒童哮喘患者中, NK細(xì)胞DNA去甲基化, 引起NK細(xì)胞活性升高[33]。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及強(qiáng)制性脊柱炎中, NK細(xì)胞均存在表觀遺傳學(xué)改變[31,32,33,34]。

一些藥物可以引起NK細(xì)胞的表觀遺傳修飾變化。Misale等[35]報(bào)道, 糖皮質(zhì)激素可以通過(guò)影響H3K27me3來(lái)降低IFN-的表達(dá), 從而抑制NK細(xì)胞的免疫功能。5-氮雜胞苷可引起NK細(xì)胞DNA去甲基化, 誘導(dǎo)相關(guān)基因激活, 促進(jìn)NK細(xì)胞活化[36]。

運(yùn)動(dòng)也可以引起NK細(xì)胞表觀遺傳學(xué)修飾發(fā)生改變。Zimmer等[37]選取30例非霍奇金淋巴瘤患者及10名健康人, 干預(yù)組每人每天騎車運(yùn)動(dòng)30min。運(yùn)動(dòng)組的患者血清巨噬細(xì)胞游走抑制因子 (MIF) 及IL-6水平升高, NK細(xì)胞組蛋白H3、H4乙?；浇档汀＝? 研究者再次證明運(yùn)動(dòng)可以通過(guò)升高組蛋白乙?；郊癗KG2D的表達(dá), 改善正常人NK細(xì)胞活化狀態(tài)[38]。

壓力及年齡的增長(zhǎng)對(duì)NK細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)也有明顯影響。創(chuàng)傷后應(yīng)激綜合征可以加速NK細(xì)胞由年齡造成的甲基化水平升高, 從而影響機(jī)體免疫狀態(tài)[39]。

綜上所述, 表觀遺傳學(xué)修飾影響著NK細(xì)胞的增殖、分化、殺傷、免疫調(diào)節(jié)等, 在NK細(xì)胞調(diào)控中, 扮演重要角色。但目前, NK細(xì)胞表觀遺傳學(xué)研究多集中在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)階段, 在臨床疾病中的應(yīng)用很少。NK細(xì)胞參與腫瘤、自身免疫疾病及感染的發(fā)病, 其異常是否與表觀遺傳學(xué)修飾有關(guān)?進(jìn)一步研究NK細(xì)胞表觀遺傳學(xué)異常在疾病發(fā)生中的作用, 將基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化, 開拓疾病中NK細(xì)胞功能異常的新思路, 并為新型藥物在臨床中的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ), 將是本課題組今后努力的方向。

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nk細(xì)胞范文第3篇

【關(guān)鍵詞】NK細(xì)胞：CIK細(xì)胞；γδT細(xì)胞：化療：小細(xì)胞肺癌

【中圖分類號(hào)】R59

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1674-0742（ 2015） 06（b）-0059-02

肺癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，致死率及發(fā)病率在惡性腫瘤中居高不下，成為當(dāng)前威脅人類生命健康安全的頭號(hào)殺手。據(jù)不完全數(shù)據(jù)分析，小細(xì)胞肺癌（SCLC）發(fā)病率占肺癌發(fā)病率的15%～20%，多發(fā)于中老年男性，與吸煙關(guān)系密切，約90%以上的患者存在吸煙史。該疾病早期癥狀具有一定隱匿性，多數(shù)患者以咳嗽、氣促、疼痛、咯血、乏力等表現(xiàn)為主，部分因未出現(xiàn)上述癥狀而延遲病情診斷，錯(cuò)過(guò)最佳時(shí)間。當(dāng)前越來(lái)越多研究報(bào)道顯示，SCLC患者存在多種免疫細(xì)胞功能缺陷，故研究者將探討方向轉(zhuǎn)移至改善患者免疫狀態(tài)上，希望以此開辟新途徑，提高SCLC患者治療效果，延長(zhǎng)其生存時(shí)間。該研究整群選取2009年8月一2014年12月間該院收治的94例小細(xì)胞肺癌患者為研究對(duì)象，以此為方向展開討論，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

整群選取該院于2009年8月-2014年12月收治的94例小細(xì)胞肺癌患者為研究對(duì)象，均通過(guò)病理檢杏及細(xì)胞診斷，符合《NCCN臨床腫瘤治療指南（2010年第1版）》中小細(xì)胞肺癌相關(guān)診斷及分期標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)患者人院順序分成聯(lián)合組（A組，n=47）和對(duì)照組（B組，n=47）兩組，A組中男25例，女22例；年齡19～62歲，平均（48.3±4.4）歲；Karnofsky功能狀態(tài)（KPS）評(píng)分（80.1±3.8）分；體力狀況ECOC評(píng)分（1.1±0.5）分；病情發(fā)展：局限期29例，廣泛期18例。B組中男24例，女23例；年齡20～63歲，平均（48.6±4.5）歲；KPS評(píng)分（80.3±3.9）分；ECOC評(píng)分（1.3±0.6）分；病情發(fā)展：局限期28例，廣泛期19例。兩組患者在一般資料對(duì)比上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比降。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合小細(xì)胞肺癌相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)者；②符合《NCCN臨床腫瘤治療指南（2010年第1版）》中相關(guān)化療指證（KPS≥70分且Ps≤2分）者；③臨床資料完整者；④預(yù)計(jì)存活期超過(guò)3個(gè)月者；⑤自愿簽署的知情同意書者。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

①合并其他嚴(yán)重疾病、功能障礙或惡性腫瘤者；②相關(guān)治療禁忌癥者；③精神障礙、意識(shí)障礙或語(yǔ)言障礙者；④中途退出治療或隨訪期失聯(lián)者；⑤未成年患者或年齡超過(guò)65歲者。

1.4 治療方法

1.4.1 B組予以單純化療方案①依托泊苷注射液（規(guī)格：5mLO.Ig，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字05253H823），100m/m?，生理鹽水稀釋后靜脈滴注，濃度30min，dl-3；②注射用順鉑（規(guī)格：1Omg，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20073652），75mg/m?，與5%葡萄糖注射液稀釋后靜脈滴注，滴注時(shí)間>30min，dl；局限期患者治療4周，廣泛期患者治療6周后觀察效果。

1.4.2 A組采用細(xì)胞免疫聯(lián)合化療方案①化療方案同B組一致；②過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療：治療第1天采集患者白體外周血單個(gè)核細(xì)胞，體外培養(yǎng)擴(kuò)增后于2周后回輸NK細(xì)胞、CIK細(xì)胞及γδT細(xì)胞，持續(xù)6d，維持治療至疾病進(jìn)展。

1.5 評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

1.5.1 療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)參考《實(shí)體瘤新的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（解讀1.1版RECIST標(biāo)準(zhǔn)）中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。以患者無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）及總生存期（os）長(zhǎng)短評(píng)估療效。

1.5.2 觀察指標(biāo)行為期2～5年隨訪，比對(duì)兩組患者總生存期及無(wú)進(jìn)展生存期差異，記錄其相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS14.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用X2檢驗(yàn)，P

2 結(jié)果

2.1 生存率及生存期對(duì)比情況分析

A.B兩組的局限期患者在PFS及1年生存率對(duì)比上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；A組局限期患者Os及2年生存率優(yōu)于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

2.2 不良反應(yīng)發(fā)生情況對(duì)比分析

兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生率對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；詳細(xì)見表3。

3 討論

nk細(xì)胞范文第4篇

目的: 探討nkg2d配體在不同發(fā)育階段樹突狀細(xì)胞（dc）表面的表達(dá)及其對(duì)自然殺傷（nk）細(xì)胞殺傷活性的影響。方法: 用細(xì)胞因子（rh il-4、 rhgm-csf、 tnf-α）體外誘導(dǎo)培養(yǎng)單核細(xì)胞來(lái)源的未成熟樹突狀細(xì)胞（idc）和成熟樹突狀細(xì)胞（mdc）并鑒定形態(tài)和表型, 免疫磁珠法分離純化nk細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)（fcm）檢測(cè)idc和mdc表面nkg2d配體mica/b、 ulbp1-3的表達(dá)。用ldh釋放法檢測(cè)nk細(xì)胞對(duì)idc和mdc的殺傷活性以及抗nkg2d單克隆抗體(mab)阻斷nk細(xì)胞后的殺傷活性。結(jié)果: 培養(yǎng)的idc和mdc具有典型的細(xì)胞形態(tài)和免疫表型特征。idc表面表達(dá)mica、 micb、 ulbp1、 ulbp3, 表達(dá)率分別為(32.39±8.30）%、 (17.75±3.40)%、 (26.71±6.48)%、 (38.37±6.89)%; mdc表面表達(dá)mica 、 ulbp3, 表達(dá)率分別為(7.82±2.67)%、 (8.36±2.42)%, 比idc表面相應(yīng)配體表達(dá)率低（p<0.01）。各效靶比nk細(xì)胞對(duì)idc的殺傷活性均比對(duì)mdc的殺傷活性高, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。抗nkg2d mab阻斷nk細(xì)胞后對(duì)idc殺傷活性比阻斷前減弱(p<0.05); 對(duì)mdc的殺傷活性與阻斷前相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。結(jié)論: nkg2d配體在idc表面表達(dá)高, 介導(dǎo)了nk細(xì)胞對(duì)idc的殺傷, 而對(duì)mdc的殺傷無(wú)影響, 是nk細(xì)胞對(duì)idc選擇性高殺傷的分子機(jī)制之一。wWw.133229.cOm

【關(guān)鍵詞】 nkg2d配體 自然殺傷細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞

expression of nkg2d ligands on dendritic cells at different development stages and its effect on cytotoxicity of nk cells

tu san-fang, guo kun-yuan*, hu liang-shan, mei jia-zhuan, zhou jian, sun ming

department of hematology, zhujiang hospital, southern medical university, guangzhou 510282, china

［abstract］ aim: to investigate the expression of nkg2d ligands on dendritic cells（dc） at different development stages and its effect on cytotoxicity of natural killer（nk） cells. methods: the monocytes were cultured into immature dendritic cells（idc） and mature dendritic cells（mdc） with cytokines. nk cells were obtained from normal peripheral blood by cd56 antibody magnetic isolation.the expression of nkg2d ligands (mica/b, ulbp1-3) was detected by flow cytometry. cytotoxicity of nk cells and the nk cells blocked with anti-nkg2d mabs against idc and mdc was tested using ldh-releasing method. results: idc and mdc were of typical morphology and phenotypes. mica, micb, ulbp1, and ulbp3 were expressed on idc and their expression rate was (32.39±8.30)%, (17.75±3.40)%, (26.71±6.48)%, (38.37±6.89)%, respectively. mica and ulbp3 were expressed on mdc and their expression rate was (7.81±3.33)% and (8.36±2.42)%, respectively, which was lower than that on mdc (p<0.01). at the each e∶t ratio cytotoxicity of nk cells against idc was stronger than that against mdc (p<0.01). cytotoxicity of nk cells blocked with anti-nkg2d mab against idc was decreased compared with that of nk cells unblocked (p<0.05) while cytotoxicity of nk cells blocked with anti-nkg2d mab against mdc showed no decrease compared with that of nk cells unblocked (p>0.05). conclusion: the expression of nkg2d ligands on idc is higher than that on mdc, which plays an important role in the cytotoxic effect of nk cells against idc, but has no effect on that aginst mdc. nkg2d-nkg2d ligands shows one of the moleculer mechanisms that nk cells kill idc selectivly.

［keywords］nkg2d ligand; natural killer cell; dendritic cell

樹突狀細(xì)胞（dc）和自然殺傷（nk）細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)最重要的組成部分, 二者之間存在相互作用［1］。ruggeri等［2, 3］研究發(fā)現(xiàn)在異基因造血干細(xì)胞移植中供者nk細(xì)胞可以通過(guò)殺傷宿主dc來(lái)降低移植物抗宿主?。╣vhd）的發(fā)生。但nk細(xì)胞殺傷dc的作用機(jī)制仍未完全明確。nk細(xì)胞主要通過(guò)表面受配體結(jié)合起殺傷作用, 本研究旨在通過(guò)檢測(cè)nkg2d配體在不同發(fā)育階段dc表面的表達(dá)水平來(lái)探索nkg2d受配體識(shí)別途徑是否參與介導(dǎo)了nk細(xì)胞對(duì)不同發(fā)育階段dc的殺傷, 為臨床運(yùn)用nk細(xì)胞降低gvhd的發(fā)生提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 rpmi1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自gibco公司。重組人白細(xì)胞介素-4 ( rh il-4)、 重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子( rhgm-csf)和腫瘤壞死因子（tnf-α）均為pep rotech公司產(chǎn)品?？筩d56免疫磁珠抗體、 macs磁柱和macs細(xì)胞分選儀均為miltenyi公司產(chǎn)品。殺傷活性檢測(cè)試劑盒（cytotox96 non-radioactive cytotoxocity assay）為promega公司產(chǎn)品。cd3fitc、 cd16pecd56pe mab為bd公司產(chǎn)品。fitc或pe標(biāo)記的鼠抗人cd80、 cd86、 hla2dr、 cd83、 cd1a單克隆抗體(mab)及其同型對(duì)照均為ebiosience公司產(chǎn)品。鼠抗人nkg2d、 mica、 micb、 ulbp1、 ulbp2、 ulbp3 mab和fitc標(biāo)記的兔抗鼠igg1購(gòu)自rnd公司。facscabilur型流式細(xì)胞儀為beckman-coulter公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 人外周血單核細(xì)胞來(lái)源的idc與mdc體外誘導(dǎo)培養(yǎng)與鑒定 常規(guī)分離健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞, 以4×109/l細(xì)胞密度接種在6孔板中, 置于37℃、 50 ml/l co2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)4 h后, 去除非貼壁細(xì)胞, 加入含20 μg/l rhil-4、 50 μg /l rhgm-csf、 100 ml/l胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)液, 置于培養(yǎng)箱培養(yǎng), 隔天半量換液, 補(bǔ)充等量細(xì)胞因子。第6天補(bǔ)加80 μg /l的tnf-α, 共培養(yǎng)9 d。每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。收集第6天和第9天細(xì)胞用25 ml/l戊二醛固定, 漂洗, 脫水, 乙酸異物脂置換, 干燥, 噴金后上機(jī)用掃描電子顯微鏡觀察鑒定其形態(tài)。同樣收集第6天和第9天細(xì)胞計(jì)數(shù)后分管, 分別加cd80pe、 cd86 pe-cy5、 hla-drpe、 cd1afe、 cd83fitc mab 4度標(biāo)記, 對(duì)照管加同型對(duì)照igg1, 用流式細(xì)胞術(shù)（fcm）檢測(cè)各分子的表達(dá), 不同時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次。

1.2.2 人外周血來(lái)源的nk細(xì)胞分離 分離另外3位健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞, 每107個(gè)細(xì)胞加入80 μl pbs和20 μl抗cd56免疫磁珠抗體, 4℃標(biāo)記15 min后洗滌, 用500 μl的pbs充分混勻后加入到磁柱中, 在macs細(xì)胞分選儀中分離, 推注器將分選的陽(yáng)性細(xì)胞推入無(wú)菌試管, 為nk細(xì)胞。cd3fitc、 cd16pecd56pe mab標(biāo)記nk細(xì)胞檢測(cè)nk細(xì)胞的純度。

1.2.3 idc、 mdc表面nkg2d配體的fcm檢測(cè) 分別收集鑒定后的idc與mdc洗滌計(jì)數(shù), 分6管, 每管109/100 ml細(xì)胞懸液, 按1 μg/106個(gè)細(xì)胞密度分別加入mica、 micb、 ulbp1、 ulbp2、 ulbp3 mab, 4度標(biāo)記30 min后洗滌, 加入fitc標(biāo)記的山羊抗鼠igg1二抗4度標(biāo)記30 min, 第6管加等量同型igg1作為陰性對(duì)照, 洗滌后以fcm檢測(cè)mica、 micb、 ulbp1、 ulbp2、 ulbp3的表達(dá)量。為避免實(shí)驗(yàn)誤差, 不同時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次。

1.2.4 nk細(xì)胞對(duì)idc與mdc殺傷活性的檢測(cè) 采用ldh釋放法［4］, 收集idc, mdc作為靶細(xì)胞, nk細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞, 按照cytotox96 non-radioactive cytotoxocity assay殺傷試劑盒說(shuō)明書操作, 倍比稀釋法按效靶比20∶1、 10∶1、 5∶1鋪板, 阻斷組先加抗nkg2d mab 10 μg/100 μl常溫下孵育15 min, 封閉nk細(xì)胞表面nkg2d受體, 再加靶細(xì)胞。顯色后elx-800酶標(biāo)儀上測(cè)a值。nk細(xì)胞殺傷率=(實(shí)驗(yàn)孔a值－靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔a值－效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔a值)/(靶細(xì)胞最大釋放孔a值－靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔a值)×100%

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理, 數(shù)據(jù)以x±s表示, 采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn), p<0.05者表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 idc和mdc的形態(tài)和表型 倒置顯微鏡下觀察第6天細(xì)胞大部分半懸浮聚集成簇生長(zhǎng), 胞體增大, 表面可見短小毛刺狀突起。第9天細(xì)胞大部分懸浮生長(zhǎng), 表面樹突結(jié)構(gòu)明顯。掃面電鏡下觀察第6天細(xì)胞大小10 μm左右, 表面突起短小, 多見薄沙或云霧狀皺褶, 符合idc的形態(tài)特征（圖1a）; 第9天細(xì)胞表面突起更多更長(zhǎng), 呈典型樹突狀結(jié)構(gòu), 云霧狀皺褶稀疏, 符合mdc的形態(tài)特征（圖1b）。fcm結(jié)果顯示第6天dc表面共刺激分子cd80和cd86分別為（40.8±7.9）%和（45.1±3.7）%, hla-dr表達(dá)為（59.9±5.2）%, 特異性分子標(biāo)志物cd1a高表達(dá)為（71.9±5.2）%, 成熟分子標(biāo)志物cd83低表達(dá)為（14.9±1.9）%, 為不成熟階段表型。第9天測(cè)得cd80、 cd86和hla-dr表達(dá)升高為（71.5±7.3）%、 （79.9±6.7）%和（88.6±6.6）%, cd1a仍高表達(dá), cd83表達(dá)升高為(65.5±3.8)%, 為成熟階段表型。

圖1 掃描電鏡下觀察dc形態(tài)（略）

fig 1 the morphologies of dc observed by scanning electron microscope

a: day 6; b: day 9.

2.2 nk細(xì)胞的純度 fcm結(jié)果顯示外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)免疫磁珠分選后nk細(xì)胞（cd3-cd16+cd56+）的純度為（91.66±4.04）%, 能滿足實(shí)驗(yàn)要求（圖2）。

圖2 免疫磁珠法分選后nk細(xì)胞的純度（略）

fig 2 purification of nk cells after immunomagnetic isolation

2.3 idc和mdc表面nkg2d配體的表達(dá) idc表面表達(dá)mica、 micb、 ulbp1和ulbp34個(gè)配體; mdc表面只表達(dá)mica、 ulbp22個(gè)配體, 且比idc表面相應(yīng)配體表達(dá)率低, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。其他配體表達(dá)率均低于5%, 視為陰性結(jié)果(表1, 圖3)。

表1 nkg2d配體在idc和mdc表面的表達(dá)率（略）

tab 1 expression of nkg2d ligands on the surface of idc and mdc

bp<0.01 vs idc.

圖3 idc和mdc膜表面nkg2d配體的表達(dá)（略）

fig 3 expression of nkg2d ligands on the surface of idc and mdc

2.3 nk細(xì)胞對(duì)idc與mdc的殺傷活性 各效靶比nk細(xì)胞對(duì)idc的殺傷活性分別高于對(duì)mdc的殺傷活性, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。nkg2d mab阻斷nk細(xì)胞后, 各效靶比nk細(xì)胞對(duì)idc的殺傷活性降低（p<0.05）; 對(duì)mdc的殺傷活性與阻斷前相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）; 阻斷后的nk細(xì)胞對(duì)idc的殺傷活性比阻斷前nk細(xì)胞對(duì)mdc的殺傷活性高, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05, 圖4）。

圖4抗nkg2d mab阻斷前后nk細(xì)胞對(duì)idc和mdc的殺傷活性（略）

fig 4 cytotoxicity of nk cells and the nk cells blocked with anti-nkg2d mab against idc and mdc

3 討論

nk細(xì)胞和dc是機(jī)體天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)中重要的組成部分, 近年來(lái)研究［1, 5］表明二者在天然免疫早期階段存在相互作用, dc能增強(qiáng)nk細(xì)胞的殺傷活性, 同時(shí)nk細(xì)胞能選擇性殺傷idc, 到目前為止其殺傷機(jī)制仍在探索中。dc根據(jù)發(fā)育階段的不同可分為idc和mdc, 其在形態(tài), 表型和功能上有所不同［6］。nk細(xì)胞的殺傷活性同時(shí)受活化性和抑制性受配體結(jié)合產(chǎn)生的信號(hào)平衡調(diào)節(jié)起作用［7］, 其活化性受體主要包括ii型跨膜蛋白受體nkg2d和nk細(xì)胞自然細(xì)胞毒受體ncr, 與配體結(jié)合向nk細(xì)胞傳遞活化性信號(hào)。nkg2d配體［8］主要包括多態(tài)性的mhc-i類鏈相關(guān)的肽a、 b（mica/b）和人巨細(xì)胞病毒ul16結(jié)合蛋白(ulbps), 它們?cè)诓煌l(fā)育階段dc的表達(dá)情況尚未見研究報(bào)道。我們通過(guò)fcm分別檢測(cè)idc和mdc表面nkg2d配體的表達(dá), 結(jié)果顯示idc表面表達(dá)mica、 micb、 ulbp1和ulbp3, 而mdc表面只表達(dá)mica和ulbp3, 且表達(dá)率很低。因此idc可以通過(guò)表面nkg2d配體與nkg2d結(jié)合激活nk細(xì)胞的殺傷活性, mdc通過(guò)nkg2d配體很難激活nk細(xì)胞。本研究殺傷試驗(yàn)顯示nk細(xì)胞對(duì)idc的殺傷活性比對(duì)mdc的殺傷活性高很多, 與其他研究結(jié)果一致［9］。nkg2d mab阻斷nk細(xì)胞后降低了nk細(xì)胞對(duì)idc的殺傷活性, 但對(duì)mdc的殺傷沒(méi)有影響。因此可認(rèn)為nkg2d受配體識(shí)別信號(hào)途徑介導(dǎo)了nk細(xì)胞對(duì)idc的殺傷, 沒(méi)有介導(dǎo)對(duì)mdc的殺傷, 是nk細(xì)胞選擇性高殺傷idc的機(jī)制之一。

nk細(xì)胞的殺傷作用除了受活化性信號(hào)作用之外, 同時(shí)受抑制性信號(hào)的共同調(diào)節(jié)作用。nk細(xì)胞抑制性信號(hào)受體主要包括殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體kir和cd94/nkg2a等, 分別與靶細(xì)胞表面的hla-ⅰ類分子和不典型的i類分子結(jié)合, 向nk細(xì)胞傳遞抑制性信號(hào)［10］。本研究結(jié)果顯示抗nkg2d mab阻斷后對(duì)idc的殺傷活性仍比未阻斷前nk對(duì)mdc的殺傷活性高, 說(shuō)明抗nkg2d mab不能完全阻斷nk細(xì)胞對(duì)idc的殺傷, 同時(shí)其他受配體識(shí)別途徑介導(dǎo)。除了其他活化性信號(hào)途徑外, 更主要的就是抑制性信號(hào)在二者強(qiáng)弱不等。ferlazzo等［11］發(fā)現(xiàn)mdc高表達(dá)抑制性配體mhc-i類分子, 而idc低表達(dá), 這可能也是idc被nk細(xì)胞選擇性殺傷的原因之一。

在異基因造血干細(xì)胞移植中利用nk細(xì)胞對(duì)idc 的殺傷清除能力, 輸入kir/hla錯(cuò)配的nk細(xì)胞可能做為一種安全有效的過(guò)繼細(xì)胞免疫治療方法用于白血病的治療, 降低gvhd的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)nkg2d配體在idc表面表達(dá), 并首次證實(shí)它直接影響nk細(xì)胞對(duì)idc的選擇性殺傷, 為臨床造血干細(xì)胞移植合理選擇供者提供了一定的理論依據(jù)。

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nk細(xì)胞范文第5篇

    神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病率占全部腦部腫瘤的50%以上。因其生長(zhǎng)活躍，沿神經(jīng)纖維呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與腦組織無(wú)明顯的界限，外科手術(shù)難以完全切除。加上腦組織對(duì)射線的耐受性差及血－腦脊液屏障對(duì)藥物滲透的限制作用，惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤對(duì)化療和放療僅為中度敏感，大部分腫瘤會(huì)在原腫瘤周邊0.5～3.0cm范圍內(nèi)復(fù)發(fā)[1]。所以需要其他輔助治療方法來(lái)控制腫瘤的復(fù)發(fā)，以延長(zhǎng)生存期，改善遠(yuǎn)期療效。nk細(xì)胞是腫瘤免疫治療的新的研究熱點(diǎn)。隨著臨床和基礎(chǔ)研究進(jìn)展，人們發(fā)現(xiàn)部分神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞有逃避nk細(xì)胞免疫殺傷的生物學(xué)行為[2]。本研究以k562細(xì)胞為對(duì)照，探討人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞u251逃逸nk細(xì)胞殺傷的機(jī)制，為提高nk細(xì)胞免疫治療效果，尋找新的免疫治療方案提供新的思路。

    1  材料和方法

    1.1  主要試劑和細(xì)胞株  nk細(xì)胞分離緩沖液和抗cd56免疫磁珠(miltenyi biotec公司)，amo1(antimica, igg1)、bmo1 (antimicb, igg1)、m295(antiulbp1, igg1)、m310(antiulbp2, igg1)、m551(antiulbp3, igg1)(德國(guó)alexander. steinle教授惠贈(zèng))，fitc標(biāo)記的鼠抗人hlaⅰ類分子單抗（w6/32, igg2a）和山羊抗小鼠igg (ebioscience公司)，rpmi1640(gibco公司)，ldh殺傷活性檢測(cè)試劑盒(promega公司)，trizol (invitrogen公司)，takara rna kit(amv)ver.3.0（takara公司），胎牛血清(杭州四季青公司)。人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株u251由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院遺傳研究所惠贈(zèng)，人紅白血病細(xì)胞株k562由本室凍存。用含10%胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基，在37℃、5%co2、充分濕度的孵箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

    1.2  nk細(xì)胞的分離純化  用梯度密度沉淀法常規(guī)分離5例健康個(gè)體外周血單個(gè)核細(xì)胞，pbs洗滌2次，計(jì)數(shù)細(xì)胞，按每107細(xì)胞加入80μl nk細(xì)胞分離緩沖液和20μl抗cd56免疫磁珠，4℃孵育15min，加入1ml的緩沖液，離心，棄上清。然后按108細(xì)胞/500μl緩沖液懸浮細(xì)胞，加入minimacs磁場(chǎng)中的分選柱，進(jìn)行分離。用500μl緩沖液沖洗分選的陽(yáng)性細(xì)胞，共3次。取下分選柱，置于無(wú)菌試管上，加入rpmi1640培養(yǎng)基1ml，用推注器推出分選的陽(yáng)性細(xì)胞，獲得cd3-cd56+細(xì)胞即為nk細(xì)胞。

    1.3  nk細(xì)胞的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)  用5%胎牛血清rpmi1640懸浮u251和k562細(xì)胞，作為靶細(xì)胞，加于96孔板中，每孔1×104細(xì)胞/50μl。以nk細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，按不同效靶比(5∶1、10∶1、20∶1、40∶1)分別加入相應(yīng)數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞50μl。另設(shè)培養(yǎng)基對(duì)照孔，效、靶細(xì)胞自然釋放孔，靶細(xì)胞最大釋放孔，各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于孵箱中培養(yǎng)4h，靶細(xì)胞最大釋放孔提前45min加10μl裂解液，離心，每孔吸取上清50μl轉(zhuǎn)入另一96孔板中，加入50μl ldh底物反應(yīng)液，室溫避光放置30min，每孔加50μl反應(yīng)終止液，酶標(biāo)儀490nm處測(cè)od值。抗體封閉試驗(yàn)以效靶比20∶1時(shí)，amo1、bmo1、m295、m310和m551分別與k562和u251細(xì)胞室溫孵育15min，再加入nk細(xì)胞檢測(cè)殺傷率。nk細(xì)胞殺傷率(%)=(實(shí)驗(yàn)組od平均值-靶細(xì)胞自然釋放組od平均值-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組od平均值)/(靶細(xì)胞最大釋放組od平均值-靶細(xì)胞自然釋放組od平均值)×100%。

    1.4  mhcⅰ類鏈相關(guān)分子a和b(mica/b)和人巨細(xì)胞病毒糖蛋白u(yù)l16結(jié)合蛋白(ulbp1～3) mrna的檢測(cè)  引物參考文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)，由上海生工公司合成。收集k562和u251細(xì)胞，用trizol一步法直接提取總rna，紫外分光光度計(jì)測(cè)rna含量。取2μg總rna，加入20μl逆轉(zhuǎn)錄體系(25mm mgcl2 2μl、10mm dntp mixture 2μl、10×rt buffer 1μl、20μmol/l特異性下游引物0.5μl、rnase free ddh2o 3.75μl、rnase inhibitor 10u、amv reverse transcriptase 2.5u)混勻，50℃ 20min，99℃ 5min，5℃ 5min終止反應(yīng)。直接在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物中加入40μl pcr反應(yīng)體系(5×pcr buffer 10μl、takara ex taq 1.25u、20μmol/l上游特異性引物0.5μl、ddh2o 29.75μl)混勻。95℃預(yù)變性5min，95℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)，72℃ 10min終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析儀觀察結(jié)果。

    1.5  mica/b和ulbp1～3和hlaⅰ分子測(cè)定  收集腫瘤細(xì)胞，pbs洗滌2次，計(jì)數(shù)細(xì)胞，分管，用直接標(biāo)記法檢測(cè)hlaⅰ類分子，按1μg/106細(xì)胞濃度加入w6/32，4℃孵育30min，pbs洗滌3次。用間接標(biāo)記法檢測(cè)mica/b和ulbp1～3分子的表達(dá)，加入amo1、bmo1、m295、m310和m551一抗，4℃作用30min，pbs洗滌后再加fitc標(biāo)記的山羊抗鼠igg1二抗，4℃孵育30min，pbs洗滌后上機(jī)，以同型igg1抗體( pharmingen公司)為陰性對(duì)照。用流式細(xì)胞儀分析1×104細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算百分率。為減少誤差，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

    1.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示， 應(yīng)用spss13.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)以及單向方差分析。

    2  結(jié)果

    2.1  nk細(xì)胞的純度  流式細(xì)胞儀檢測(cè)nk細(xì)胞(cd3-cd16+cd56+)的純度為（89.4±3.26）%。

    2.2  nk細(xì)胞殺傷活性

    2.2.1  不同效靶比時(shí)nk細(xì)胞殺傷k562和u251細(xì)胞的活性見表1。同一效靶比時(shí)nk細(xì)胞對(duì)兩種細(xì)胞的殺傷率之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。不同效靶比之間nk細(xì)胞對(duì)k562細(xì)胞殺傷率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，對(duì)u251細(xì)胞殺傷率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。表1  不同效靶比時(shí)nk細(xì)胞殺傷k562

    和u251細(xì)胞的情況（％，±s）

    5∶110∶120∶140∶1k562細(xì)胞29.32±1.1745.33±1.7858.37±2.3572.37±3.06  u251細(xì)胞4.69±0.323.47±0.845.36±1.135.81±0.82

    2.2.2  效靶比20∶1時(shí)用抗體分別封閉靶細(xì)胞表面相應(yīng)分子后nk細(xì)胞的殺傷情況見表2。阻斷靶細(xì)胞nkg2d的各配體，nk細(xì)胞對(duì)k562細(xì)胞殺傷率有明顯下降，對(duì)u251細(xì)胞的殺傷率無(wú)明顯變化；阻斷hlaⅰ分子，nk細(xì)胞對(duì)k562細(xì)胞殺傷率無(wú)明顯變化，對(duì)u251細(xì)胞的殺傷率明顯上升。

    2.3  k562、u251細(xì)胞mica/b和ulbp1～3基因的表達(dá)情況  兩種細(xì)胞在mrna水平均表達(dá)5種基因，見圖1。

    2.4  k562和u251細(xì)胞表面mica、ulbp1～3和hlaⅰ分子的表達(dá)情況，見表3、圖2。

    3  討論

    nk細(xì)胞是天然免疫的主要承擔(dān)者，是機(jī)體抗腫瘤免疫的第一道天然防線。nk細(xì)胞功能的發(fā)揮由其細(xì)胞表面活化性和抑制性受體傳遞的信號(hào)共同決定[4]。nk細(xì)胞表面主要抑制性受體為殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(kir)，其共同特征是胞質(zhì)區(qū)末端含有免疫受體酪氨酸抑制基序(itim)，其配體為mhcⅰ分子。當(dāng)抑制性kir與mhc分子結(jié)合后，引起kir分子在胞膜中聚集，使itim的酪氨酸磷酸化，向nk細(xì)胞傳遞抑制性信號(hào)，使其不殺傷靶細(xì)胞[5]。nk細(xì)胞表面活化性受體大致分為兩大類，一類是mhcⅰ類分子特異性受體；另一類是非mhcⅰ類分子特異性受體，包括c型凝集素受體

    1：dna marker；2：mica（635bp）；3：micb（690bp）；4：ulbp1（319bp）；5：ulbp2（327bp）； 6: ulbp3（321bp）；7：βactin (510bp)

    圖1  u251、k562細(xì)胞mica/b和

    ulbp1～3 mrna的表達(dá)情況

    和自然細(xì)胞毒受體(ncr)。nkg2d是c型凝集素受體超家族中的成員[6]，是nk細(xì)胞表面重要的活化受體，其配體為mica/b和ulbp1～3。nkg2d與腫瘤細(xì)胞表面的配體分子相互交聯(lián)后，可以直接活化nk細(xì)胞，觸發(fā)nk細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，在腫瘤免疫監(jiān)視中起著非常重要的作用。

    本研究結(jié)果顯示，同一效靶比時(shí)nk細(xì)胞殺傷u251細(xì)胞的活性明顯低于殺傷k562細(xì)胞的活性，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。表明以nk細(xì)胞殺傷敏感的細(xì)胞k562為對(duì)照，u251細(xì)胞抵抗nk細(xì)胞的殺傷。用rtpcr方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，k562和u251細(xì)胞在mrna水平均表達(dá)mica/b和ulbps基因，但流式細(xì)胞儀并未在u251細(xì)胞表面檢測(cè)到mica/b和ulbps分子。另外，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)u251細(xì)胞高表達(dá)hlaⅰ類分子，而k562細(xì)胞卻不表達(dá)。因此可以推測(cè)，u251細(xì)胞通過(guò)hlakir信號(hào)途徑向nk細(xì)胞傳遞抑制性信號(hào)，抑制性信號(hào)的參與會(huì)提高nk細(xì)胞的活化閾值。而u251細(xì)胞又不表達(dá)所有5個(gè)nkg2d的配體，不能向nk細(xì)胞傳遞活化性信號(hào)。因此與活化性信號(hào)相比，抑制性信號(hào)明顯占優(yōu)勢(shì)，所以u(píng)251細(xì)胞抵抗同種異體nk細(xì)胞的殺傷。而k562細(xì)胞的情況則恰恰相反，其表面缺乏hlaⅰ分子，不會(huì)通過(guò)hlakir系統(tǒng)向nk細(xì)胞傳遞抑制性信號(hào)，沒(méi)有抑制性信號(hào)對(duì)活化性信號(hào)的對(duì)沖，nk細(xì)胞活化的閾值就低。同時(shí)k562細(xì)胞又高表達(dá)活化性受體 表2  效靶比20∶1時(shí)阻斷靶細(xì)胞表面相應(yīng)分子后nk細(xì)胞的殺傷情況表3  u251和k562細(xì)胞表面mica/b和ulbp1～3的表達(dá)情況 圖2  k562細(xì)胞和u251細(xì)胞表面nkg2d的配體和hlai類分子的表達(dá)情況

    nkg2d的5種配體，因此任何同種異體nk細(xì)胞都表現(xiàn)出對(duì)k562細(xì)胞有很強(qiáng)的殺傷力。在效靶比為20∶1時(shí)我們用w6/32抗體阻斷腫瘤細(xì)胞表面的hlaⅰ分子后，nk細(xì)胞對(duì)u251細(xì)胞的殺傷能力明顯上升，而對(duì)k562細(xì)胞的殺傷活性沒(méi)有明顯變化。用amo1、bmo1、m295、m310和m551抗體分別封閉靶細(xì)胞表面的相應(yīng)配體，結(jié)果顯示，nk細(xì)胞對(duì)k562細(xì)胞的殺傷能力明顯降低，而對(duì)u251細(xì)胞的殺傷活性沒(méi)有明顯變化。說(shuō)明nkg2d配受體和hlakir信號(hào)系統(tǒng)確實(shí)參與調(diào)節(jié)nk細(xì)胞對(duì)u251細(xì)胞的殺傷作用，也證實(shí)了我們上述的推理。但抗體阻斷試驗(yàn)并沒(méi)有完全阻斷nk細(xì)胞殺傷k562細(xì)胞的活性，說(shuō)明除了nkg2d介導(dǎo)的殺傷活性外，尚有其他信號(hào)通路參與nk細(xì)胞對(duì)其的殺傷作用。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和friese等[3]的研究一致。friese等發(fā)現(xiàn)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞ln229雖然表達(dá)mica，但由于該類腫瘤細(xì)胞高表達(dá)hlaⅰ類分子，因而對(duì)nk細(xì)胞抵抗。將轉(zhuǎn)染mica基因的ln229細(xì)胞(ln229/mica)和未處理的ln229細(xì)胞接種于裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)ln229/mica腫瘤生長(zhǎng)明顯延遲，體積明顯縮小。該研究表明增強(qiáng)nk細(xì)胞活化性信號(hào)，可以對(duì)抗抑制性信號(hào)，提高nk細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。另外本研究發(fā)現(xiàn)u251細(xì)胞在mrna水平表達(dá)mica/b和ulbp基因，但細(xì)胞表面mica/b和ulbp蛋白的表達(dá)率極低。因此，研究如何使這些基因轉(zhuǎn)錄成蛋白表達(dá)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面，或者降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的hlaⅰ分子，增強(qiáng)nk細(xì)胞的殺傷活性，將會(huì)為尋找新的免疫治療方案提供新的思路。 

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