新世紀(jì)伊始，人類社會(huì)步入了快速發(fā)展和劇烈變動(dòng)之中。在這一系列的發(fā)展變動(dòng)之中，克隆技術(shù)備受關(guān)注，日漸成為人們生活中的一個(gè)重要名詞。一方面，由于克隆技術(shù)給人類生活帶來的美好前景，人們對(duì)它寄予了無限的期望；而另一方面，又由于其可能給人類社會(huì)造成不確定的抑或是災(zāi)難性的后果，不少人視之為洪水猛獸而強(qiáng)烈反對(duì)。2004年11月19日聯(lián)合國(guó)一次會(huì)議放棄了制定一項(xiàng)禁止生殖性克隆人的國(guó)際條約的努力。在這次大會(huì)上，由于爭(zhēng)論陷入僵局，由哥斯達(dá)黎加等60國(guó)提出的要求全面禁止克隆人試驗(yàn)的提議，和由比利時(shí)提出的禁止生殖性克隆人研究、允許治療性克隆研究的提議均未通過?？寺〖夹g(shù)目前發(fā)展?fàn)顩r如何？克隆人究竟離我們有多遠(yuǎn)？克隆技術(shù)產(chǎn)生了哪些倫理問題？克隆技術(shù)可以禁止嗎？倫理學(xué)不能接納這項(xiàng)新技術(shù)嗎？我們應(yīng)該怎樣對(duì)待克隆技術(shù)的發(fā)展？本文擬就這些問題進(jìn)行一些討論。

一、克隆技術(shù)的發(fā)展使克隆人成為可能

上世紀(jì)初，韋伯（H.J.Webber）創(chuàng)造了“克隆”這一詞，其含義指由單個(gè)祖先個(gè)體經(jīng)過無性繁殖而產(chǎn)生的其他個(gè)體。由于該詞構(gòu)詞簡(jiǎn)短，容易發(fā)音，能清晰表達(dá)出準(zhǔn)確的意思，因此這一術(shù)語很快得到學(xué)術(shù)界的認(rèn)同并加以廣泛使用[1](P.160)。1952年，科學(xué)家開始用青蛙進(jìn)行克隆實(shí)驗(yàn)。從此以后，動(dòng)物克隆的試驗(yàn)結(jié)果不斷涌現(xiàn)。1970年克隆青蛙實(shí)驗(yàn)取得突破，青蛙卵發(fā)育成了蝌蚪。1984年第一只胚胎克隆羊誕生。1997年2月24日，英國(guó)羅斯林研究所的科學(xué)家用取自一只6歲成年羊的乳腺細(xì)胞培育成功一只克隆羊。1998年7月，日本科學(xué)家利用成年動(dòng)物體細(xì)胞克隆的兩頭牛犢誕生。2000年1月，美國(guó)科學(xué)家宣布克隆猴成功。2000年3月14日，曾參與克隆小羊“多莉”的英國(guó)PPL公司宣布，他們成功培育出5頭克隆豬。

隨著一系列克隆技術(shù)突破的完成，克隆人從技術(shù)上來講已成為可能。有的科學(xué)家認(rèn)為，從技術(shù)上說克隆人并不比克隆其他哺乳動(dòng)物更困難?？寺∪思磳⒊鍪赖南⒁膊粩鄠鱽怼Ｒ獯罄摹翱寺】瘛卑驳僦Z里曾宣布，克隆胎兒將于2003年1月問世。2003年第一期《發(fā)現(xiàn)》雜志也把2002年“命名”為“克隆年”，理由是克隆技術(shù)在當(dāng)時(shí)已經(jīng)進(jìn)入了克隆人的階段。該雜志斷言：“雖然世界不想要克隆人，但克隆人卻將要出現(xiàn)?！?/p>

但是至今我們沒有見到克隆人的問世，原因是盡管克隆技術(shù)出現(xiàn)了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但是仍然存在著一些目前尚沒有解決的問題。在理論上，分化的體細(xì)胞克隆對(duì)遺傳物質(zhì)重編（細(xì)胞核內(nèi)所有或大部分基因關(guān)閉，細(xì)胞重新恢復(fù)全能性的過程）的機(jī)理還不清楚；克隆動(dòng)物是否會(huì)記住供體細(xì)胞的年齡，克隆動(dòng)物的連續(xù)后代是否會(huì)累積突變基因，以及在克隆過程中胞質(zhì)線粒體所起的遺傳作用等問題還沒有解決。在實(shí)踐中，存在著低著床率、高流產(chǎn)率的問題，維爾穆特研究組在培育“多莉”的實(shí)驗(yàn)中，融合了277枚移植核的卵細(xì)胞，僅獲得了“多莉”這一只成活羔羊，成功率只有0.36％，同時(shí)進(jìn)行的胎兒成纖維細(xì)胞和胚胎細(xì)胞的克隆實(shí)驗(yàn)的成功率也分別只有1.7％和1.1％。此外，生出的許多個(gè)體表現(xiàn)出生理缺陷或畸形。以克隆牛為例，日本、法國(guó)等國(guó)培育的許多克隆牛在降生后兩個(gè)月內(nèi)死去[2]。觀察結(jié)果表明，部分牛犢胎盤功能不完善，其血液中含氧量及生長(zhǎng)因子的濃度都低于正常水平；有些牛犢的胸腺、脾和淋巴腺未得到正常發(fā)育；克隆動(dòng)物胎兒普遍存在比一般動(dòng)物發(fā)育快的傾向，這些都可能是死亡的原因。

雖然存在各種各樣的問題，但幾年來克隆技術(shù)的發(fā)展表明，世界各科技大國(guó)都不甘落后，誰也沒有放棄克隆技術(shù)研究。同時(shí)，克隆人的出現(xiàn)越來越成為可能，人們對(duì)其可能產(chǎn)生的倫理問題表現(xiàn)出了空前的擔(dān)心。

1材料與方法

基因DNA模板、PCMV陽性血清、表達(dá)載體pET32a（＋）均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心提供，2月齡健康雄性白兔（體重2kg）購自雅安市某家兔養(yǎng)殖基地?？寺≥d體pMD19－TSimple，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ、T4DNA連接酶、IPTG、蛋白質(zhì)Marker購自大連寶生物工程有限公司；、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、購自北京天根生化科技有限公司；N，N’－亞甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、SDS、TEMED、考馬斯亮藍(lán)R－250、2－巰基乙醇、溴酚藍(lán)、瓊脂糖、甘油、氨芐青霉素、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、硫酸銨等均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，其他化學(xué)試劑均為分析純。引物的設(shè)計(jì)與合成應(yīng)用．0b等分子生物信息軟件對(duì)PCMVgB基因及其編碼氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并選擇gB基因2305～2574bp優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)作為目的序列，參照NCBI上的豬巨細(xì)胞病毒gB基因序列（登錄號(hào)：FJ844360．1），應(yīng)用Oligo7．0軟件設(shè)計(jì)引物P1、P2，在引物P1、P2的5′端分別引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和HindⅢ，用于PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體的連接，并在引物P1、P2酶切位點(diǎn)后分別引入起始密碼子ATG和終止密碼子TAG。P1／P2擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)270bp，上述引物送上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如下（下劃線處為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），下劃線處為HindⅢ酶切位點(diǎn)）。PCMVgB基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)的PCR擴(kuò)增以gB基因DNA為模板，分別以P1、P2為上游引物和下游引物，對(duì)PCMVgB基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)進(jìn)行體外擴(kuò)增。PCR反應(yīng)的程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性，經(jīng)30個(gè)循環(huán)后，于72℃延伸8min。基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)表達(dá)載體的建立及重組蛋白的表達(dá)與純化將PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳后，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收目的片段，將目的片段連入pMD19－TSimple克隆載體并轉(zhuǎn)化入E．coliDH5α后抽提質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)?；蚪M測(cè)序，并使用EcoRⅠ和HindⅢ進(jìn)行酶切，將酶切后的目的片段連接入pET32a（＋）載體，并命名重組質(zhì)粒為pET32a（＋）－gB，轉(zhuǎn)化入E．后將重組表達(dá)菌命名為E．。使用濃度為0．2mg／L的IPTG誘導(dǎo)E．重組表達(dá)菌表達(dá)后，將表達(dá)產(chǎn)物通過組氨酸標(biāo)簽融合蛋白純化柱進(jìn)行純化，并測(cè)定純化后的蛋白質(zhì)濃度。PCMVgB基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白的反應(yīng)原性分析以純化的PCMVgB基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白作為抗原，PCMV陽性血清為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG為二抗進(jìn)行試驗(yàn)，并設(shè)置PCMV陰性血清對(duì)照組，鑒定PCMVgB基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白的反應(yīng)原性。多克隆抗體的制備及抗體效價(jià)的測(cè)定使用純化后的PCMVgB基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白與弗氏佐劑按1∶1體積比進(jìn)行乳化后制成油乳劑，對(duì)健康家兔進(jìn)行免疫，第4次免疫完成后對(duì)試驗(yàn)家兔采取心血，將血液收集至離心管中，先于常溫傾斜放置30min，再轉(zhuǎn)至37℃培養(yǎng)箱中放置1h，最后轉(zhuǎn)入4℃冰箱中放置過夜，于4000r／min離心15min分離血清。將分離的血清無菌進(jìn)行分裝后于－20℃保存?zhèn)溆?，并避免反?fù)凍融。以純化后的PCMVgB優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白（質(zhì)量濃度為0．62μg／mL）作為抗原，以瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)驗(yàn)證經(jīng)PBS緩沖液稀釋后的多克隆抗體效價(jià)。鑒定以純化的PCMVgB優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白作為抗原，制備的多克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行Western－blot鑒定，以免疫前的家兔血清作為陰性對(duì)照，鑒定該多克隆抗體的反應(yīng)性。

2討論

自1950年P(guān)CMV在英國(guó)被發(fā)現(xiàn)以來，該病毒就因?yàn)槠涿庖咭种铺匦砸约澳軌蛲ㄟ^跨物種器官移植而感染人與其他動(dòng)物而備受關(guān)注，但由于該病毒分離困難，導(dǎo)致了對(duì)該病毒的研究一直落后于其他皰疹病毒科病毒。囊膜糖蛋白B（gB）是PCMV重要的跨膜糖蛋白，也是特定細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的主要靶蛋白，是淋巴因子激活的自然殺傷細(xì)胞的識(shí)別對(duì)象，且gB蛋白具有良好的免疫原性，并在誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫中起著重要作用，對(duì)該蛋白進(jìn)行研究有助于了解PCMV的感染機(jī)制，為該病毒感染的防治奠定了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)構(gòu)建了pET32a（＋）－gB高效重組表達(dá)質(zhì)粒，應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)以可溶性形式高效表達(dá)了PCMVgB優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白，成功表達(dá)并純化了PCMVgB優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白，并驗(yàn)證了其具有良好的反應(yīng)原性，可以作為間接ELISA檢測(cè)的包被抗原，通過瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和Western－blot試驗(yàn)，也證實(shí)了制備的多克隆抗體可以與gB蛋白特異性結(jié)合。本研究為進(jìn)一步分析PCMVgB蛋白的生物學(xué)特性，建立PCMV抗體血清學(xué)診斷方法奠定了重要基礎(chǔ)，為制備早期檢測(cè)PCMV抗體的檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

作者：江一帆劉驍單位：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)

一電路設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)

國(guó)內(nèi)已有的研究文獻(xiàn)，只是對(duì)仲裁器PUF進(jìn)行了改進(jìn)，但并沒有提高仲裁器PUF在不同芯片中的差異性以及系統(tǒng)的穩(wěn)定性，也未對(duì)具體的應(yīng)用進(jìn)行描述。對(duì)此，本文設(shè)計(jì)了由多路仲裁器PUF電路、多數(shù)表決器和運(yùn)算門陣列三部分組成的防克隆電路，用以解決上述問題。

1多路仲裁器PUF電路設(shè)計(jì)

仲裁器使用D觸發(fā)器，D觸發(fā)器不易進(jìn)入亞穩(wěn)態(tài)。即使信號(hào)傳輸?shù)难訒r(shí)差小于D觸發(fā)器建立時(shí)間，它的輸出也是一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)，不是‘1’就是‘0’。但根據(jù)以往研究者的資料和實(shí)際實(shí)驗(yàn)測(cè)試，使用了D觸發(fā)器的仲裁器PUF存在以下的問題:相同電路在不同芯片間的傳輸延時(shí)差異性減小，張俊欽等人測(cè)得該差異產(chǎn)生的概率約為11.2%;針對(duì)此問題，文中共設(shè)計(jì)了8支仲裁器PUF電路。每支仲裁器PUF由128個(gè)開關(guān)單元組成，結(jié)構(gòu)完全一致，但選擇位F(0．．．127)不同。左半部分為8支仲裁器PUF，右半部分為其中一支仲裁器PUF的局部放大圖。F［0］～F［10］為一部分選擇位，“信號(hào)輸入”代表仲裁器PUF的輸入端，“信號(hào)輸出”代表仲裁器PUF的輸出端。每一支仲裁器PUF電路都通過運(yùn)算門陣列與被保護(hù)電路的輸出進(jìn)行運(yùn)算。因此，只要有一支電路的延時(shí)差發(fā)生差異，最終的輸出都會(huì)發(fā)生變化。而最終的輸出發(fā)生變化的概率，即8支電路中至少有一支在不同芯片中產(chǎn)生延時(shí)差異的概率為1－1－0．()1128=61.34%。理論上，PUF的數(shù)量越多，上述的概率就越高，但考慮到FPGA資源有限，過多的PUF電路會(huì)占用過多的空間，因此只設(shè)計(jì)了8支電路，而此概率已遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于D.Lim等人得到的23%的概率。在設(shè)計(jì)中，通過分析不同的選擇位對(duì)應(yīng)的響應(yīng)，確定每支PUF電路的選擇位，使得輸出結(jié)果中，各有4支電路的輸出為‘1’和‘0’，保持了‘1’和‘0’的均衡性，從而加大敵方破解的難度。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，使用8支電路達(dá)到了預(yù)期的效果。此外，仲裁器PUF的輸出取決于上下兩條線路的延時(shí)差，而電路的布局布線對(duì)延時(shí)有很大的影響。每次進(jìn)行重新編譯時(shí)，布局布線都有可能發(fā)生改變，導(dǎo)致延時(shí)差發(fā)生變化，從而引起輸出的改變。同時(shí)，即使在同一塊芯片中，也可能存在著工藝不均勻的情況，所以仲裁器PUF布局在不同的位置，就可能會(huì)產(chǎn)生不同的輸出?？紤]到這點(diǎn)，在實(shí)際操作中，本文使用了Altera公司QuartusII的高級(jí)功能邏輯鎖(LogicLock)，將設(shè)計(jì)好的仲裁器PUF電路鎖定在了芯片的固定區(qū)域內(nèi)，減小了布局布線及芯片不均勻產(chǎn)生的影響，同時(shí)給被保護(hù)電路的設(shè)計(jì)留出了足夠的芯片資源，使得兩者不會(huì)產(chǎn)生干擾，還有利于團(tuán)隊(duì)的分工和協(xié)作，提高效率。

2多數(shù)表決器為保證系統(tǒng)穩(wěn)定

要求仲裁器PUF在同一芯片中對(duì)同一激勵(lì)的響應(yīng)保持恒定。在實(shí)際應(yīng)用中，氣溫變化與電壓不穩(wěn)是電子設(shè)備面臨的兩個(gè)最大難題，仲裁器PUF也不能例外。盡管D.Lim等人測(cè)得仲裁器PUF在同一芯片中對(duì)同一激勵(lì)的響應(yīng)發(fā)生變化的概率只有0.7%，但該數(shù)據(jù)是在溫度范圍為40～70℃，電壓變化幅度為±2%的情況下測(cè)得的。若電子設(shè)備要求必須能在極端環(huán)境下正常工作，上述測(cè)試環(huán)境下的數(shù)據(jù)顯然不能滿足要求。因此必須進(jìn)行電路設(shè)計(jì)，保證輸出的穩(wěn)定性。借鑒文獻(xiàn)提到的方法，對(duì)每一支仲裁器PUF在同一激勵(lì)下的多次響應(yīng)進(jìn)行寄存，然后對(duì)寄存的響應(yīng)進(jìn)行多數(shù)表決。由此可以有效避免因外部環(huán)境變化而對(duì)輸出產(chǎn)生的影響。其中多數(shù)表決器由VHDL寫成，并生成符號(hào)(symbol)，與仲裁器PUF在原理圖環(huán)境中進(jìn)行編譯，

1材料與方法

下游引物P，下劃線處分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。上述引物由大連寶生物工程有限公司合成。L基因的克隆與鑒定以綿羊痘病毒基因組DNA為模板，采用50μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將純化的PCR產(chǎn)物與mple克隆載體連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆培養(yǎng)后小量制備質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并測(cè)序。綿羊痘病毒E3蛋白的生物信息學(xué)分析將測(cè)序結(jié)果應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫ORFfinder程序推導(dǎo)出相應(yīng)的氨基酸序列，并應(yīng)用Weblab服務(wù)器中法對(duì)SPPVE3蛋白和VVE3蛋白的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)柔性區(qū)域分析分別使用軟件的法和法進(jìn)行預(yù)測(cè)。蛋白中氨基末端和羧基末端2個(gè)功能域的三級(jí)結(jié)構(gòu)使用SWI服務(wù)器進(jìn)行預(yù)測(cè)。重組載體的構(gòu)建及重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化E3L重組載體和表達(dá)載體pGEX4T－1分別用酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后用凝膠回收試劑盒回收目的條帶，16℃連接過夜，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。毒株綿羊痘病毒古浪株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分子免疫與環(huán)境控制課題組分離、鑒定和保存。主要試劑TaqDNA聚合酶、載體、大腸桿菌菌株連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ均購自大連寶生物工程有限公司；pGEX4T－1表達(dá)載體表達(dá)菌、GST結(jié)合樹脂和硝酸纖維素膜購自公司；氨芐青霉素、IPTG、弗氏佐劑和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗山羊IgG購自Sigma公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自公司；化學(xué)發(fā)光底物購自公司；X光底片、顯影及定影液均購自柯達(dá)公司；其他試劑均為進(jìn)口分析純。引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中登錄號(hào)為的基因組序列，利用軟件設(shè)計(jì)了1對(duì)引物，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為534bp。上游引物P，挑取陽性克隆培養(yǎng)后小量制備質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并測(cè)序。將鑒定正確的重組載體轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）pLysS感受態(tài)細(xì)胞，37℃振蕩培養(yǎng)至?xí)r，加入IPTG至終濃度為1mmol／L誘導(dǎo)培養(yǎng)離心10min收集菌體，處理后進(jìn)行檢測(cè)。用裂解緩沖液重懸誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎（超聲5s，停8s）至溶液澄清，離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS－PAGE，分析重組蛋白SPPVE3的可溶性。重組蛋白使用Novagen公司的GST結(jié)合樹脂進(jìn)行純化。重組蛋白鼠抗血清的制備及分析選取周齡的BALB／c小鼠進(jìn)行免疫：初次免疫時(shí)，用純化后的重組蛋白SPPVE3與等量弗氏完全佐劑混合，經(jīng)乳化后皮下多點(diǎn)注射；第14天，用相同劑量的重組蛋白與弗氏不完全佐劑混合，乳化后加強(qiáng)免疫。二免后第14天采血，分離血清，用純化的重組蛋白SPPVE3包被ELISA板，進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，測(cè)定血清效價(jià)。

2SPPVE3L基因的序列分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)經(jīng)測(cè)序分析

SPPVE3L基因全長(zhǎng)534bp，編碼177位氨基酸，分子質(zhì)量約為。使用法分析，基因與VVE3L基因的核苷酸序列具有50．8％的一致性，在氨基酸水平上具有34．9％的一致性（50．0％的相似性。從功能結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列分析蛋白的氨基酸末端序列與E3蛋白ZDBD相比具有28．2％的一致性（47．4％的相似性），而羧基末端與DRBD相比具有41．9％的一致性（52．7％的相似性）使用法預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)α－螺旋主要存在于位氨基酸；β－折疊主要分布于位氨基酸；利用法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)柔性，結(jié)果表明較大的柔性區(qū)域分布于位氨基酸。根蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)服務(wù)器，對(duì)SPPVE3蛋白的氨基末端和羧基末端2個(gè)潛在的功能結(jié)構(gòu)域氨基酸序列進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的同源建模。構(gòu)建的氨基酸區(qū)域分別為3～71和102～173位氨基酸，參考模板分別為E3蛋白的Z－DNA結(jié)合域和PKR的dsRNA結(jié)合域。序列一致性分別為40．58％和26．027％，E值分別為E－21和1．8E－16，表明模型構(gòu)建可靠。重組質(zhì)粒的鑒定及重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化經(jīng)酶切鑒定（見圖6）及測(cè)序鑒定，表明E3L重組載體構(gòu)建正確。含有重組載體的BL21（DE3）pLysS重組菌在濃度為1mmol／L條件下誘導(dǎo)4h后，經(jīng)E電泳分析，顯示在46ku處表達(dá)出一條明顯的條帶，分子質(zhì)量與預(yù)期大小一致。經(jīng)可溶性分析，表明重組蛋白主要以可溶形式存在于菌體中，經(jīng)GST結(jié)合瓊脂可純化出目的條帶重組蛋白SPPVE3鼠抗血清的制備分析用綿羊痘病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和制備的鼠抗血清對(duì)SPPVE3蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果顯示所制備的鼠抗血清可以與重組蛋白發(fā)生反應(yīng)。對(duì)制備的重組蛋白SPPVE3鼠抗血清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，其效價(jià)為。

3討論

蛋白是痘苗病毒中重要的免疫逃避因子，主要由位于氨基酸末端的ZDBD和羧基末端的DRBD兩個(gè)關(guān)鍵的功能結(jié)構(gòu)域組成。其中，E3蛋白的羧基末端能夠通過其dsRNA結(jié)合域阻斷病毒復(fù)制周期中產(chǎn)生的dsRNA，抑制了Toll樣受體、人視黃酸誘導(dǎo)基因／RIG樣受體以及細(xì)胞內(nèi)PKR和OAS等各類抗病毒信號(hào)通路和抗病毒分子的活性，病毒得以正常復(fù)制。目前，除了VV外，E3蛋白的同源蛋白在羊口瘡病毒（ORFV）中已進(jìn)行了較為深入的研究，結(jié)果顯示在體外細(xì)胞試驗(yàn)中，ORFVE3蛋白取代VVE3蛋白后構(gòu)建的重組病毒VV／ORFVE3與野生型VV致病性并無明顯差別，但在動(dòng)物試驗(yàn)中，的致病性顯著降低。等報(bào)道SPPV基因組的第34號(hào)開放閱讀框編碼VVE3蛋白的同源蛋白，表明SPPV可能編碼類似VVE3蛋白的免疫逃避因子。SPPV主要引起感染綿羊全身皮膚（特別是身體無毛部分）出現(xiàn)典型的痘瘡，造成家畜產(chǎn)奶量下降、體重減輕、流產(chǎn)率增加以及對(duì)肺炎和皮毛蠅蛆病的易感性增加，同時(shí)也會(huì)造成直接死亡。本試驗(yàn)中，筆者以綿羊痘病毒甘肅古浪株為模板克隆出綿羊痘病毒E3L同源基因，基因全長(zhǎng)534bp，編碼177個(gè)氨基酸。經(jīng)過序列比對(duì)，SPPVE3蛋白與VVE3蛋白核苷酸序列的一致性達(dá)到50．8％，而氨基酸序列一致性為34．9％（相似性為50．0％）。從功能結(jié)構(gòu)域角度分析，SPPVE3蛋白與VVE3蛋白ZDBD的一致性只有28．2％（相似性為47．4％）；而DRBD一致性雖然高達(dá)41．9％（相似性為52．7％），但在決定dsRNA結(jié)合活性的和A174氨基酸殘基中，第174位氨基酸殘基中A→S的突變可能使其dsRNA結(jié)合活性大大降低，推測(cè)SPPVE3蛋白對(duì)干擾素的抑制效應(yīng)將會(huì)減弱。在本研究中，以pGEX4T－1為載體，表達(dá)出大小為46ku左右的重組蛋白。利用純化后的重組蛋白免疫BALB／c小鼠獲得鼠抗血清，經(jīng)間接ELISA測(cè)定效價(jià)為。利用制備的抗體能夠分析SPPV在感染細(xì)胞后E3蛋白的表達(dá)情況以及對(duì)PKR等抗病毒分子的影響，為闡明羊痘病毒的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1材料和方法

蛹期開始將雌雄分開飼養(yǎng)，羽化后喂以5%的蜂蜜水。養(yǎng)蟲室溫度為26℃，相對(duì)濕度為70%～80%，光周期16D∶8L?？俁NA的提取及cDNA第一鏈的合成為測(cè)定氣味結(jié)合蛋白基因的組織表達(dá)譜，取3齡幼蟲頭部和去除頭部的剩余組織，取3日齡雌雄成蟲的不同組織(觸角、去除觸角的頭、胸、腹、足、翅)，其中，雄蟲觸角收取30對(duì)，雌蟲觸角收取40對(duì)，其他組織適量，重復(fù)3次。組織收取后立即放入液氮中，－70℃保存?zhèn)溆?。按照說明書，用SVTotalRNAIsolationSystem提取總RNA，然后用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，－20℃保存?zhèn)溆?。RACE擴(kuò)增利用本研究組委托深圳華大科技有限公司測(cè)得的二化螟基因組數(shù)據(jù)，與GenBank中的OBP序列進(jìn)行比對(duì)得到CsupOBP1基因的cDN段。根據(jù)片段序列，設(shè)計(jì)合成5''''GSP和3''''GSP引物。依據(jù)擴(kuò)增試劑盒操作說明，進(jìn)行RACEcDNA第一鏈的合成及PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目標(biāo)條帶經(jīng)AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收后，連接到pEASYTM-T3載體上，然后轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化后的菌落經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取單個(gè)白色菌落放入含有0．1%Amp的LB培養(yǎng)液中，在250r/min、37℃下震蕩培養(yǎng)12～16h后，采用質(zhì)粒提取試劑盒(Omega，USA)提取質(zhì)粒，送南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

2序列分析

測(cè)定為了明確二化螟OBP1基因的組織表達(dá)譜，利用ABI7500Real-timePCRSystem進(jìn)行了相對(duì)表達(dá)量測(cè)定。內(nèi)參基因?yàn)?-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因和轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子4(E2F)基因，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列。RT-qPCR反應(yīng)體系為模板2．0μL，超純水補(bǔ)足至20μL。采用兩步法標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行擴(kuò)增:95℃預(yù)變性30s;95℃5s，60℃34s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)后進(jìn)行溶解曲線分析，以排除非特異性PCR產(chǎn)物的污染，空白對(duì)照模板以超純水代替cDNA。蛋白的原核表達(dá)與純化根據(jù)二化螟OBP1閱讀框序列及表達(dá)載體pET-30a(+)設(shè)計(jì)帶有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)(以下劃線標(biāo)示)的引物序列。以成蟲觸角cDNA為模板，采用高保真性和高擴(kuò)增效率的DNA聚合酶PrimeSTARHSDNAPolymerase，按照PrimeSTAR說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物回收，再連接到pEASYTM-T3載體中并轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒DNA并測(cè)序驗(yàn)證。將含有目的片段的重組質(zhì)粒DNA和pET-30a(+)質(zhì)粒DNA分別進(jìn)行雙酶切，然后將目的片段連接到pET-30a(+)載體，再轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。用含抗生素卡那霉素的LB平板進(jìn)行篩選，挑取陽性克隆，小量提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂板培養(yǎng)后挑取單菌落接種于5mLLB培養(yǎng)液(含Kan50μg/mL)中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日，將所得菌液按1/100(v/v)的比例接種于新鮮的LB培養(yǎng)液(含Kan50μg/mL)中，37℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至OD600=0．6時(shí)，加入IPTG(終濃度為1mmol/L)，37℃下250r/min振蕩培養(yǎng)5h。將菌液8000×g離心20min后收集沉淀(菌體)，加入預(yù)冷的Resuspensionbuffer(20mmol/LTris-HCl，0．5mmol/LNaCl，pH7．將沉淀重新懸浮，超聲破碎后用12000×g離心15min，分別收集上清及沉淀，用SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白是否為可溶性蛋白。重組蛋白的純化使用裝有填料的親和層析柱XK16/20，對(duì)純化后的重組蛋白進(jìn)行腸激酶酶切以切除His-tag標(biāo)簽，酶切后的重組蛋白再次過親和層析柱。純化后的目的蛋白經(jīng)過透析(除鹽)、冷凍干燥后，保存于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

3熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)

緩沖液中，配成蛋白溶液，測(cè)定濃度。熒光探針1-NPN和氣味物質(zhì)(植物揮發(fā)性化合物，見表2)溶于甲醇中，使其終濃度為1mmol/L，作為工作液。以1-NPN為探針，利用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)定氣味物質(zhì)和OBP間的親和力已有很多報(bào)道(Zhouetal．，2004b;Heetal．，2011;Qiaoetal．，2011;孫紅巖等，2011;LiuNYetal．，2012;LiuSJetal．，2012;張婷等，2012;Lietal．，2013)。首先測(cè)定CsupOBP1與1-NPN的結(jié)合曲線。將蛋白溶液加入20mmol/L的Tris-HCl緩沖液中，使其終濃度為2μmol/L，按和20μmol/L的濃度梯度加入1-NPN，每次加入后反應(yīng)2min，在337nm激發(fā)，記錄熒光發(fā)射情況，利用其熒光值計(jì)算出該蛋白與1-NPN的結(jié)合常數(shù)，然后利用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)定氣味物質(zhì)和蛋白的結(jié)合能力。在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，蛋白和1-NPN的濃度均為2μmol/L，反應(yīng)時(shí)間為2min，在337nm激發(fā)，記錄熒光值(初始熒光值)。然后將被測(cè)氣味物質(zhì)按終濃度和20μmol/L的濃度梯度加入到1-NPN和蛋白的混合液中，每次加入后反應(yīng)2min，記錄熒光值。對(duì)于濃度在20μmol/L時(shí)相對(duì)熒光值降到60%以下的氣味物質(zhì)，再進(jìn)行2次重復(fù)試驗(yàn)，以3次重復(fù)計(jì)算有關(guān)參數(shù);對(duì)于結(jié)合能力較低的氣味物質(zhì)，第一次測(cè)定后不再進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。計(jì)算熒光值降低到初始熒光值一半時(shí)氣味物質(zhì)的濃度，即IC50值，利用公式Ki=IC50/(1+［1-NPN］/K1-NPN)計(jì)算各氣味物質(zhì)的結(jié)合常數(shù)，其中［1-NPN］為未結(jié)合的1-NPN濃度，K1-NPN為1-NPN與二化螟OBP1的結(jié)合常數(shù)(Banetal．，2003)。